[发明专利]一种转基因植物非预期效应的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种转基因植物非预期效应的分析方法。

背景技术

随着转基因技术的发展，转基因生物安全问题在国内外已经引起极大的关注。研究转基因植物的非预期效应对于转基因植物的监测和推广使用具有重要的意义。DNA甲基化能够引起植物的转基因沉默。在转基因植物中，内部因子和环境条件可影响被转化的外源基因的甲基化状态，因而改变了被转化外源基因的表型。另一方面，病毒侵染植物后，能够通过DNA甲基化等机制诱导植物体内与病毒同源的基因沉默；与之类似，如果被转化的外源基因与转基因植株中某个内源基因的同源性较高，被转化的外源基因能够引起该内源基因的表达沉默。然而，关于被转化的外源基因是否影响转基因植株中与被转化外源基因同源性不高的内源基因的表达，目前尚未见报道。新一代转基因植物中常导入多个外源基因，为复合性状转基因植物。这些外源基因之间、以及外源基因与受体植株的内源基因之间存在互作，可使一些在受体植株中甲基化的DNA序列在新一代转基因植株中去甲基化，进而使这些DNA序列中的本不应该表达的内源基因在新一代转基因植株中表达。如果这些与被转化外源基因同源性不高的内源基因是致敏蛋白基因、毒素物质合成的关键酶基因以及其它主要的基因，转基因植物则产生非预期的致敏性、毒性以及其它效应，所以有必要建立转基因植物内源基因甲基化状态的分析方法。亚硫酸氢盐测序技术是Frommer等在1992年提出的，已被广泛用于分析基因启动子区域的甲基化状态。国内外尚未将该技术用于分析转基因植物中与被转化外源基因同源性不高的内源基因的甲基化状态。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，首次将亚硫酸氢盐测序技术不仅用于分析转基因植物中与被转化外源基因同源性不高的内源基因启动子区域的甲基化状态，而且用于分析该内源基因编码区域的甲基化状态，进而研究转基因植物的非预期效应，建立了分析转基因植物是否具有非预期效应的技术体系，有助于转基因植物的监测和推广使用，具有重要的经济效益和社会效益。

发明人提供的具体技术方案如下：

一种转基因植物非预期效应的分析方法，具体步骤如下：

1、基因组DNA的提取和亚硫酸氢盐处理

分别提取转基因植株以及受体植株的基因组DNA。对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。

2、PCR扩增产物的克隆、测序及甲基化水平分析

选择致敏蛋白基因、毒素物质合成的关键酶基因以及其他与代谢相关的主要的内源基因，对其启动子和编码区的CpG岛进行引物设计。以亚硫酸氢盐处理的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。克隆PCR扩增产物，进行测序后，计算PCR扩增产物的甲基化水平,分析转基因植株中是否具有非预期效应。

3、内源基因的荧光定量PCR分析

对转基因植株中甲基化水平显著降低的内源基因，利用荧光定量PCR技术，研究其表达水平变化，验证转基因植株中是否具有非预期效应。

其中所述的致敏蛋白基因可选自glymBd28K、glymBd30K、seedvacuolarthiolprotease、stress-inducedproteinSAM22、seedbiotinylatedprotein68kDaisoform、pathogenesis-relatedprotein、profilin(PRO2)、pollenallergenLolp11-like、cytokinininducedmessage(CIM1)、minorallergenAlta7、Arah1、calcium-bindingallergen、Olee8、majorallergenMald1等；

毒素物质合成的关键酶基因可选自bown-blrktypeproteaseinhibitor、trypsininhibitor、urease、agglutinin、myo-inositol-3-phosphatesynthase等；

具体可视转基因植物的种类和外源基因的情况选择上述的备选内源基因，并且既对其启动子又对其编码区的CpG岛进行引物设计。以亚硫酸氢盐处理的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。