[发明专利]一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法

权利要求书

1.一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC的分离制备方法，通过二步复合酶消化释放大鼠胸主动脉VSMC制备大鼠胸主动脉收缩型血管平滑肌细胞VSMC,包括如下步骤:

1)取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主动脉；

2)反复冲洗胸主动脉，去掉其表面粘附的凝血等组织块；

3)剔净血管的周围组织，然后放入复合酶液中、在37℃的气浴恒温振荡器里消化45分钟，随后剥离血管外膜层、刮除内膜层和剥离中膜层；

4)以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS漂洗分离的中膜层，置于干净的培养皿进行快速剪碎为1-2mm³，然后转入放有复合酶液的6孔板内、并于孵箱中37℃、5％CO₂，消化1小时；

5)终止消化，用10ml的注射器抽打组织消化液直至细胞基本从组织残片中脱离，再用细胞筛过滤获得悬液；取滤网上的组织，重复抽打和过滤，将多次过滤后的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分、离心5分钟收集细胞；

6)取含20％FBS的DMEM悬浮细胞，种入6孔板进行培养；

其特征在于，其步骤3)中复合酶液的配制：以HBSS新鲜配制含有浓度为1mg/ml二型胶原酶、浓度为1mg/ml胰蛋白酶抑制剂和浓度为7.08μl/ml胰肽酶的复合酶液；复合酶液配方及用法：Ⅱ型胶原酶1mg/ml，胰蛋白酶抑制剂1mg/ml，胰肽酶7.08μl/ml，以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS为溶剂，定容为1ml；每条大鼠胸主动脉平均每次取1ml复合酶进行消化。

2.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，复合酶液的消化条件：1)1段中膜/1ml酶液，在37℃、60转/分的气浴恒温振荡器里初步消化45分钟；2)剪碎的1段中膜组织/1ml酶液/孔的6孔板，在37℃细胞培养箱内再消化1小时。

3.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，所述大鼠取90-110g健康雄性大鼠，活体状态下取出胸主动脉。

4.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，分离所得的大鼠胸主动脉VSMC的培养和传代操作为：将步骤5)所得获得的细胞悬液进行离心收集后重悬于含20％胎牛血清的DMEM培养基，接种于一个6孔板的孔内(P0代)；2天后观察；7天后细胞长满，形成明显的“峰-谷”交错的致密细胞层，以0.25％胰酶消化传代于1个10cm培养皿(P1代)；7天左右后细胞再次长满、消化并传代于2-3个10cm培养皿(P2代)；待7天左右P2代细胞长满后进行计数，将P2代细胞进行冻存、传代为P3代细胞，用作收缩型VSMC的实验。

5.根据权利要求4所述的分离制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，P0-P2代VSMC以DMEM+20％FBS+1％P/S培养基进行培养，P3-后代VSMC以1：1DMEM-F12+20％FBS+1％P/S培养基进行培养。