[发明专利]一种催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种催化黄酮苷元葡萄糖苷化的基因工程菌及其应用,具体而言，本发明敲除了底盘生物细胞的β‑葡萄糖苷水解酶基因，降低糖苷化产物的内源性降解；然后对底盘生物细胞参与糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖(UDP‑Glu)合成的2个关键酶磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP1)基因进行高表达调节，再组合表达一个具有催化黄酮苷元葡萄糖苷化的尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因，从而获得了具有高效地催化黄酮化合物葡萄糖苷化的基因工程菌株，最终在10升发酵罐内以野黄芩素为催化底物发酵54小时，糖苷化产物野黄芩素‑7‑O‑葡萄糖的产量达到1200mg/L。本发明采用的策略为微生物法生物催化化学小分子糖苷化提供了一种技术借鉴。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及利用合成生物学技术构建一种具有催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程菌及其应用。

技术背景

黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于自然界的多酚类化合物，最早是指以2-苯基色原酮(flavone)为母核而衍生的一类化合物，现在泛指两个苯环(A环和B环)通过中间三碳环(C环)相互连接而成的以C6-C3-C6为基本骨架的一系列化合物。黄酮类化合物是多种药用植物的有效成分，如黄芩素是植物黄芩的主要药用活性成分，在植物体内多以游离态或与糖结合成苷的形式存在，具有多种生理和药理活性，如抗氧化、抗抑郁和抗肿瘤等生理活性；已经被用于临床的如野黄芩苷(商品名：朗瑞西乐)在我国已制成注射剂作为活血化瘀、通脉止痛的药物应用；大豆苷元8-C-葡萄糖苷，即葛根素注射液在我国用于辅助治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、视网膜动、静脉阻塞、突发性耳聋，而且国外也越来越多把葛根素作为食品添加剂使用，用于保健。

但是由于大多数黄酮苷元及部分黄酮苷类化合物在水相中溶解度较低，限制了其制剂的开发。目前对黄酮类化合物进行分子修饰主要是以提高其水溶性为目的，对其水溶性改善所涉及的化学反应主要是糖苷化修饰，而对其糖苷化修饰目前研究最多的是葡萄糖苷化反应。糖苷化修饰可以提高黄酮类化合物水溶性和生物利用度，增加黄酮类化合物的结构和功能的多样性。因此，对黄酮类化合物的葡萄糖苷化修饰是一种极具潜力的结构修饰技术，能促进黄酮类药物的临床应用。

对黄酮类化合物进行糖苷化修饰包括化学修饰法和生物催化法，对黄酮类化合物进行糖苷化修饰生物催化法主要包括微生物法和酶法。

化学修饰法的技术瓶颈在于位置选择性的用苯基、苄基或甲氧基等把某一羟基保护，然后再进行糖苷化反应，再脱去保护基团，最终得到目标产物。例如：对黄酮的酚羟基先用酰基进行保护，再高选择性的脱保护基，然后与活化的糖基供体(如糖基三氯乙酰亚胺酯)进行糖苷化反应，最后再脱去其它保护基团获得黄酮糖苷化产物(Li M,Han X,YuB.Facile synthesis of flavonoid 7-O-glycosides.J Org Chem,2003,8:6842-6845)。这种葡萄糖苷化的化学修饰反应步骤复杂，收率低，副产物多，难以进行规模化放大和生产，不具有生产实用价值。

微生物法和酶法进行葡萄糖苷化修饰反应条件温和，无需进行保护和脱保护反应，立体和区域选择性高，可以定向高效地生物催化黄酮苷元或部分水溶性低的黄酮苷发生糖苷化修饰。