[发明专利]一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans(L.)Schott)是鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物，主要分布于中国、日本、朝鲜等地，以中国黑龙江省为分布中心，在五大连池地区分布面积较大。香鳞毛蕨主要生长在高寒地区的滑石坡、火山岩浆缝中。王全喜、Momose等对鳞毛蕨科植物的配子体发育进行了大量的研究，但是关于香鳞毛蕨愈伤组织的诱导和再生植株的方法研究尚未见报道。香鳞毛蕨是一种药用植物，对皮肤病具有很好的疗效，具有一定的开发前景，而野生的香鳞毛蕨资源也因其药用价值正遭到严重的破坏。应用蕨类植物孢子进行组织培养，可以建立蕨类植物的快繁体系。在香鳞毛蕨组织培养研究中，由于通过组织培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易产生内生真菌，所以以野生香鳞毛蕨为外植体诱导愈伤很难实现，且愈伤诱导过程中容易产生褐化现象，所以香鳞毛蕨愈伤组织诱导方面尚未报道，并且通过茎尖和幼嫩叶片基部进行愈伤组织诱导也未见报道。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，该方法是将香鳞毛蕨孢子制备成无菌的孢子悬浮液后接种到改良的Knop′s培养基上，先黑暗处理萌发后进行培养，获得孢子体，将获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖和幼嫩叶片基部作为外植体，接入添加6-BA和NAA的培养基中进行培养，形成绿色小球体；将绿色小球体和孢子体茎尖接种于含有6-BA和2,4-D的培养基中进行增殖分化形成愈伤组织。

优选地，所述方法，步骤如下：

1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，获得孢子体；

2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖或幼嫩叶片基部作为外植体，接入1/2MS+6-BA+NAA+蔗糖的固体培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；

3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体的茎尖接入1/2MS+6-BA+2,4-D+蔗糖的固体培养基中培养，形成愈伤组织后加入到1/2MS+蔗糖的固体培养基进行分化培养，获得香鳞毛蕨愈伤组织。

优选地，所述培养基，pH值为5.7-5.8.

优选地，所述培养，温度为25±2℃，光照12h，黑暗12h，光强150μmol·m^-2·s^-1-180μmol·m^-2·s^-1。

优选地，步骤1)所述改良的Knop′s培养基，含有NaH₂PO₄ 0.25g，KNO₃ 0.25g，MgSO₄0.25g，Ca(NO₃)₂ 1.0g和蒸馏水1000mL。

优选地，步骤1)所述1/4MS+蔗糖的固体培养基，为1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。

优选地，步骤1)所述1/2MS+蔗糖的固体培养基，为1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。

优选地，步骤2)所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L；所述NAA，浓度为0.5mg/L-5.0mg/L。

优选地，步骤3)所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L。

优选地，步骤3)所述2,4-D，浓度为0.5mg/L-1.5mg/L。

优选地，步骤3)所述1/2MS+蔗糖的固体培养基，为1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。

优选地，所述方法，步骤如下：

1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，获得孢子体；