[发明专利]使用MES和MOPS作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子

说明书

本发明申请是基于申请日为2013年10月23日，申请号为201380067814.0 (国际申请号为PCT/US2013/066319)、名称为“使用MES和MOPS作为流动 相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月24日提交的美国申请序列号61/717,880的优先 权，其通过提述以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及使用多峰(multimodal)树脂和包含Good's缓冲液的洗脱缓冲 液来纯化或富集生物分子的方法。

背景技术

多峰树脂(也称混合模式树脂)是包含至少两种不同的基团的层析介质，其 中所述基团与靶分子通过至少两种不同的机制相互作用。例如，多峰离子交 换剂携带带电基团(例如，带正电的氨基基团、带正电的季铵基基团、带负电 的羧酸基团、带负电的磺酸基团)，所述带电基团可通过电荷-电荷相互作用与 靶分子相互作用。这些多峰离子交换剂额外携带其他可与靶分子通过不同作 用模式(如疏水相互作用、范德华相互作用、偶极相互作用、阳离子-π相互作 用或氢键)进行相互作用的基团。

EP2167526B1描述使用包含含有疏水部分和带负电部分的配体的多峰 树脂纯化凝血因子VIII。洗脱用包含高浓度的盐(>1.5M)、至少40％(w/v)的 乙二醇、丙二醇或其组合和钙离子的洗脱缓冲液实施。

US2011/0160435A1描述另一使用多峰树脂纯化凝血因子VIII的工艺。 洗脱缓冲液包含至少一种在pH6至8带正电的氨基酸。优选地，所述氨基酸 选自下组：赖氨酸、精氨酸和组氨酸，且所述氨基酸以高于0.4M，特别是高 于0.5M的浓度使用。

US2011/0166332A1描述用于从液体蛋白制备物通过将所述制备物与多 峰阴离子交换剂接触来分离至少一种非聚集蛋白的方法。实验部分描述使用 在20mMTris、20mMHepes、20mMMES、50mMNaCl中包含1M甘氨酸 的洗脱缓冲液及pH9.0至pH4.5的线性梯度分离非聚集IgG。

发明内容

在第一方面，本发明涉及用于纯化或富集生物分子的方法，所述方法包 括如下步骤：

(a)提供包含所述生物分子的水溶液；

(b)将所述水溶液与多峰树脂接触；

(c)任选地用水性洗涤缓冲液洗涤所述多峰树脂；

(d)用水性缓冲溶液从所述多峰树脂洗脱所述生物分子，其中所述水性缓 冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：至少15mM的Good's 缓冲液；总浓度为0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半 胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、 甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸 中的一种或多种；总浓度为0-400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、 硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、 氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、 氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和0％-60％(v/v)的乙二 醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；并

(e)收集包含生物分子的级分，由此获得纯化或富集形式的生物分子。

在一个实施方案中，所述水性缓冲溶液包含15mM至2.5mM的Good’s 缓冲液，如至少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good’s 缓冲液。在另一实施方案中，所述水性缓冲溶液包含10mM-400mM的丙氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨 酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化 铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化 钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化 钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和1％-60％(v/v)的乙二醇或 丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。

在一个实施方案中，在水性缓冲液中的所述Good’s缓冲液是MES、MOPS 或Tris。

第二方面，本发明涉及通过根据所述第一方面的方法可获得的纯化的生 物分子，如蛋白。