[发明专利]一种检测抑芽丹的试纸条及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及抑芽丹的检测，具体是一种用于检测抑芽丹的胶体金试纸条，其特别适用于烟叶中抑芽丹残留的检测。

背景技术

抑芽丹又称马来酰肼，化学名称为顺丁烯二酰肼（Maleic Hydrazide，MH），是一种植物生长调节剂和选择性除草剂。抑芽丹可阻碍植物细胞分裂和降低光合作用效率，因此常被用于抑制蔬菜如马铃薯、洋葱和大蒜等贮藏期发芽，也用于烟草种植中控制烟叶腋芽的生长。有研究称抑芽丹是一种诱变致癌剂，一定剂量下会导致细胞染色体断裂，从而产生细胞毒性，因此抑芽丹残留量日益受到关注。我国规定，大蒜、洋葱、葱中抑芽丹的最大残留限量（MRL）为15 mg/kg，马铃薯中抑芽丹的MRL为50 mg/kg；国际食品法典规定，大蒜、洋葱、葱中抑芽丹的MRL为15 mg/kg，马铃薯中抑芽丹的MRL为50 mg/kg；欧盟规定大蒜中抑芽丹的MRL为15 mg/kg；美国规定，洋葱中抑芽丹的MRL为15 mg/kg，马铃薯中抑芽丹的MRL为50 mg/kg；国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）规定烟草中抑芽丹的指导性残留限量（GRL）为80 mg/kg。

抑芽丹的残留分析方法有多种：蒸馏分光光度法（AOAC）、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）、气相色谱法、毛细管电泳法、极谱法等，另外也有流动注射法和脉冲伏安法等方法，其中最常用的是前3种分析方法。但是AOAC法对蒸馏装置要求高，样品前处理复杂，操作繁琐，耗碱量大，仪器腐蚀严重；HPLC-UV法中抑芽丹很难与样品中的干扰杂质分开，无法满足实际样品的检测要求；使用HPLC-MS法测定抑芽丹的仪器成本则相对较高。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的检测抑芽丹的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的问题，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的试纸条及其制备方法和应用，以实现对大批量样品中抑芽丹进行快速检测和现场监控。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种检测抑芽丹的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中，所述反应膜上具有包被有抑芽丹半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有抑芽丹单克隆抗体-胶体金标记物；所述抑芽丹半抗原-载体蛋白偶联物由抑芽丹半抗原与载体蛋白偶联得到；所述抑芽丹单克隆抗体是以抑芽丹半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。

所述抑芽丹半抗原是由磺酸基马来酸酐与硫酸肼反应生成磺酸基抑芽丹，再与3-羟基丙酸反应得到，其分子结构式为：

所述羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。

所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

一种制备上述试纸条的方法，包括以下步骤：

1）制备喷涂有抑芽丹单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有抑芽丹半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）将磺酸基马来酸酐与硫酸肼反应生成磺酸基抑芽丹，再与3-羟基丙酸反应，制备抑芽丹半抗原；

2）将抑芽丹半抗原与载体蛋白偶联，制备抑芽丹半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用抑芽丹半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌抑芽丹单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）分别将抑芽丹半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线（T）和质控线（C）上；

6）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

7）将制备的抑芽丹单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到抑芽丹单克隆抗体-胶体金标记物；