[发明专利]一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法

权利要求书

1.一种新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：染色体玻片标本的制备，新疆沙冬青种子在28℃温箱中常规培养，待根尖生长至2-3厘米时，切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润，置密闭容器中用N₂O处理2.5小时，取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟，即转入70%乙醇中固定，置-20℃长期备用，取固定后的2-3个根尖，用蒸馏水洗净，切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中，37℃解离45分钟，离心先后用冷蒸馏水，无水乙醇洗涤两遍，最后放入30微升冰醋酸中，每张玻片滴5微升左右悬液展片，空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体，镜检分散良好的染色体玻片，置-20℃长期备用；

S2：18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性，选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物，以新疆沙冬青为模板扩增重复序列，采用Nicktranslation法制备探针，端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针，Am13引物为fwd和Am13以新疆沙冬青为模板扩增重复序列。

2.分别标记FITC绿色和TexasRed红色荧光；

S3：探针与染色体共变性，制备好的染色体玻片，经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理1分钟固定染色体，在染色体位置加5微升的探针，其质量不超过100纳克，盖上盖玻片，放入密闭保湿的饭盒中，在沸水中煮沸15分钟，迅速冷却变性的染色体和探针；

S4：杂交与杂交后洗脱，遮光变性的玻片和探针，取出玻片放入55℃烘箱中，经过大于4小时的保温复性杂交，取出玻片置于含2×SSC溶液的玻片染色缸中，室温漂洗5分钟，去除玻片，接着转至另一含2×SSC溶液的玻片染色缸，55℃漂洗25分钟，取出玻片，空气晾干后保湿；

S5：制片与信号检测，在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI和5微升2×SSC溶液，盖上盖玻片，在盖玻片上覆上吸水纸，用橡皮敲打1-2分钟，使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察，找到良好的染色体分裂相，用不同的激发光获得，蓝色，红色和绿色的杂交信号；用LeciaCW4000FISHsoftware进行图像采集与合成。

3.如权利要求1所述的新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述步骤S2中的Nicktranslation法制备探针，成分为：DNA(200纳克/毫升)，10.0微升；10×Nicktranslation缓冲液，2.0微升；荧光标记的dNTP(1mM)，0.5微升；无荧光标记的dNTPs(2mM)，2.0微升；DNA聚合酶I(10U/微升)，8.0微升；DNase(100mU/微升)，0.4微升；总体积22.9微升；制备方法为：混合物混匀后放入PCR仪15°C保温2小时；加入175微升的含140纳克/微升鲑鱼精DNA的5×TAEpH5.2终止反应，并混匀，加入500微升大于2小时沉淀探针后16000rpm；离心30分钟，70%乙醇洗涤2遍，加入100微升的2×SSC溶解探针，使探针终浓度为20纳克/微升，-20℃避光储存备用。

4.如权利要求1所述的新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述新疆沙冬青的核型模式为2n=2x=18=2m(SAT)+4m+10sm+2st。