[发明专利]一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养NK细胞的方法

说明书

本发明公开了一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养NK细胞的方法。所述搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料，所述生物反应器含有其外包裹减小剪切力材料的搅拌桨，使用该生物反应器培养NK细胞。本发明使用生物反应器培养NK细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料，可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。本发明培养过程中不停的搅拌，为动态系统，有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。本发明方法不仅可以大量扩增NK细胞，而且所得NK细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养NK细胞的方法。

背景技术

NK细胞属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞总数的5％-10％，是机体重要的免疫细胞，具有广谱抗肿瘤细胞作用。NK细胞不依赖于抗原刺激作用就可以非特异直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的靶细胞，对肺癌、肝癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、骨癌等均有效果。NK细胞对造血细胞来源的肿瘤细胞更为敏感，对淋巴瘤和白血病细胞的作用更为明显。因此，NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用，是抗瘤免疫的第一线细胞，能迅速溶解某些肿瘤细胞。

目前，临床试验显示NK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景。NK细胞过继免疫治疗疗法是采用特殊的培养方法，把癌患者本身的NK细胞在体外培养增殖，使细胞数目扩大数千倍且细胞毒活性极大增强后，再回输到患者的体内，是一种简单有效、安全又积极的最新强力治癌疗法。

如今，很多实验室尝试大规模培养NK细胞，以便用于临床肿瘤的治疗，从外周血中分离得到单个核细胞，用培养基接种到培养瓶中，通过添加IL-2等细胞因子促进NK细胞在体外大量扩增，再分装到培养瓶中或者培养袋中扩增培养。现有NK细胞的培养规模小，操作复杂，步骤繁琐，扩增倍数低，所扩增得到的数量不够用于临床治疗，而且培养密度不能过高，浪费培养基，不利于节约成本和培养空间。此外表面抗原表达量低，杀伤效果差。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养NK细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种使用生物反应器培养NK细胞的方法，搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料。

优选地，所述使用生物反应器培养NK细胞的方法，包括以下步骤：

用X-VIVO 15培养基将种子NK细胞按照1×10⁶cells/ml的密度接种于培养瓶中，分别添加1％培养基体积的IL-15溶液、IL-2溶液和OKT-3溶液，在37℃、5％CO₂条件下培养，当培养体系达到一定体积后，转入生物反应器中继续培养至两周，每2～3天补充适量的培养基、IL-2和IL-15；

所述IL-15溶液的浓度为100～1000U/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。

优选地，所述IL-15溶液的浓度为500U/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml。

优选地，当培养体系大于500ml时，转入2L生物反应器中继续培养。

优选地，在生物反应器中培养NK细胞的条件为：溶氧量为50％，pH7.2，搅拌速度为45rpm。

优选地，所述种子NK细胞通过以下方法获得：