[发明专利]一种用于培育抗氧化微生物的基因

说明书

本发明发现了一种用于培育抗氧化微生物的基因。本发明构建了含该基因的重组质粒，将其导入原核宿主细胞大肠杆菌表达菌株BL21中。实验证明，本发明发现的基因在原核生物中表达后，能够提高细胞的抗氧化能力。

技术领域

本发明涉及一种用于培育抗氧化微生物的基因。

背景技术

耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans R1,DR)具有对电离辐射、UV辐射、DNA损伤试剂等抗性，是研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株。曾有人对耐辐射异常球菌中大量功能未知基因(如IrrE、Csp等蛋白)进行研究，比如，将D.radiodurans R1中4个与植物抗旱相关的基因在原核宿主细胞和植物中表达后，能够增强宿主的耐盐抗性等。

然而，对本研究发现的来源于D.radiodurans R1新基因dwh，并未见其在提高细胞抗氧化能力方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是从D.radiodurans R1中发现一种用于培育抗氧化微生物的新基因。

本发明通过如下研究发现：

1、耐辐射异常球菌R1中含有编码Why(Water stress and Hypersensitiveresponse)类似蛋白的基因，命名为dwh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白(Dwh蛋白)具有抗氧化的功能，可用于培育抗氧化微生物，进而为培育具有抗氧化性状的植物提供参考依据，其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、利用http://web.expasy.org/protparam/对Dwh蛋白氨基酸序列进行在线预测，该蛋白由99个氨基酸组成，分子式C₄₆₆H₇₇₂N₁₃₄O₁₃₈，其分子量为10.46kDa，理论等电点为9.94，不稳定指数29.04，属于稳定蛋白质；对Dwh蛋白氨基酸序列分析发现，该蛋白富含Leu(15.15％)、Val(12.12％)、Ala(10.1％)、Thr(10.1％)，带负电氨基酸残基总数(Asp+Glu)为7，带正电氨基酸残基总数(Arg+Lys)为9，其中疏水氨基酸残基含量为50.5％，总平均疏水指数(GRAVY)为0.165，同时，采用KyteDoolittle方法对Dwh蛋白进行疏水性分析也显示出其高度的疏水特性(图1)。因此，推测该蛋白是一类典型的疏水蛋白。此外，二级结构预测显示(图2)，Dwh蛋白由6个β折叠和靠近C端的1个α螺旋组成。

3、获得D.radiodurans R1dwh基因的缺失突变株Δdwh

通过PCR获得dwh基因上下游基因片段(dwh-U和dwh-D)，同时获得编码卡那霉素抗性蛋白的Km基因片段(K)(图3)，采用融合PCR技术将dwh-U、K、dwh-D三片段融合，获得dwh-UKD重组片段。然后将重组片段通过同源重组技术转化D.radiodurans R1感受态细胞，在含有Km抗性的TGY平板上进行压力筛选，获得dwh基因的缺失突变株Δdwh，并进行PCR及测序验证(图4)(见实施例1)。

4、D.radiodurans R1 dwh基因缺失突变株Δdwh的抗氧化实验

1)对野生型DR及突变株Δdwh分别进行氧化胁迫处理(80mM H₂O₂处理30min)，观察不同菌株在氧化胁迫条件下的存活能力。结果显示，氧化胁迫条件下试验菌株存活能力均有下降，缺失dwh基因的突变株Δdwh与野生型DR菌株相比更加敏感，菌株存活能力下降1个数量级(见实施例2和图5、6)。结果表明dwh基因编码的蛋白对D.radiodurans R1耐受氧化胁迫具有重要贡献。