[发明专利]蛋白酶水解肠粘膜工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域的一种蛋白酶水解肠粘膜工艺。

背景技术

肝素钠是一种富含阴离子的粘多糖硫酸酯，由动物体内的肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，因最初从肝脏中提取，故名肝素。临床使用的肝素是从动物肠、肺粘膜、血管壁等处提取 获得的钠 ( 锂 ) 盐，肝素钠 ( 锂 ) 具有抗凝血、抗炎、抗癌等多种生物学功能，但长期使用会 有诸如出血、骨折等负作用。20 世纪 80 年代初期发现低分子肝素钠 (LMWH，(8000Da) 具有 更强的活性和较小负作用，成为主要的临床抗凝血药。

目前国外已有10 多种LMWH 相继问世，全球四大制药企业均有该类产品的销售，我 国是主要的肝素原料国，产量约占全球的一半。应用于临床的 LMWH 是由普通肝素为原料制 备获得，制备方法主要有生物酶法、化学裂解法两种。它们各有优势，肝素酶降解反应条件 温和、专一性高、副产物少而且引入一个紫外生色团，检测方便，但酶的价格昂贵，难 以跨越工业生产的界线。化学裂解法不可避免的会改变肝素钠的结构、影响活性等。中国 专利 ( 授权号 CNl096034) 公开了一种纯化的肝素裂分其制备方法和含有它们的药物组合物。纯化 的肝素裂分通过如下步骤制备：向肝素钠中加入亚硝酸盐，pHl— 5 处理 20— 50 分 钟，再在碱介质中以硼氢化钠还原，用 HCL 破坏过量硼氢化钠并用乙醇沉淀分级，将得到的 溶液暴露在紫外照射系统下，温度为 5℃一 50℃，pH 为 3— 8，色谱纯化，最后用氯化钠和 乙醇沉淀分离得降解肝素钠。美国专利 ( 公开号 3099600) 公开了一种色谱技术分离纯化 肝素钠的方法：将肝素钠粗品溶于缓冲溶液中，加入 5— 12 倍肝素钠重量的离子交换树脂 TEAM-c01lulose 或 DEAE-c01lulose，后用缓冲液洗涤，盐洗脱，乙醇沉淀、干燥得产品。上 述方法为工业上典型的制备及纯化肝素钠的过程，生产工艺复杂、成本高，而且没有提及对 肝素钠的结构类似物多硫酸软骨素这一主要杂质的去除方法。

发明内容

本发明的目的为了改进现有技术的不足而提供一种蛋白酶水解肠粘膜工艺；

该发明提供一种简便的低分子肝素钠制备、纯化技术，制得的低分子肝素钠平均分子质量 在 4．5KDa 左右，效价不低于 180U ／ mg，高于中国药典要求的 170U ／ mg，且依据中国药典 肝素钠检测标准检测合格。

本发明的技术方案为：一种蛋白酶水解肠粘膜工艺，其具体步骤如下：

(1) 将粗品肝素钠溶于 NaCl 溶液中，机械搅拌至肝素钠全部溶解，向溶液中加入 碱液直至产生沉淀，静置，过滤除去不溶物，得滤液。

(2)将步骤 (1) 中滤液以碱液调 pH 至 9．5— 11，加入 H202 溶液，在 10— 30℃

下 反应 2．5— 3．5 小时，得反应液。

(3)将步骤 (2) 得到的反应液升温至 30— 50℃，此后每隔 2．5— 3．5 小时补加 H20 。

(4)向步骤 (3) 得到的反应液中加入吸附剂，磁力搅拌，过滤除不溶物，得滤液；

(5) 将步骤 (4) 中的滤液通过平衡好的凝胶色谱柱，收集低分子量的肝素钠洗脱液。

(6) 将步骤 (5) 中的低分子量的肝素钠洗脱液用弱碱性离子交换树脂吸附，分别 以三种浓度的 NaCl 溶液洗脱，收集第一种 ( 最低 )、第三种 ( 最高 ) 浓度的 NaCl 洗脱液并 混合。

(7) 将步骤 (6) 中的混合洗脱液，在磁力搅拌下降温至一 5— 8℃，再用乙醇沉淀、 真空干燥得产品。

步骤 (1) 中 NaCl 溶液的质量百分浓度为 1．2— 1．8％；NaCl 溶液的用量为 2— 3mL ／ g 肝素钠粗品量 ；静置时间 1— 2 小时。

步骤 (1) 和 (2) 的碱液均为 NaOH 或 KOH 溶液；碱液的浓度为 1— 1．5mOl/L。

步骤 (2) 和 (3) 中所加入的 H202 溶液和 NaCl 溶液的体积比为 3— 5 ：100 ；步骤 (2) 中 H202 溶液的浓度为 1— 5mOl/L，步骤 (3) 中 H202 溶液的浓度为 1— 3mOl/L。

步骤 (3) 中每次补加完 H20 ：溶液后测定 pH，使 pH 在 6．8— 7．5 之间。步骤 (4) 中所述的吸附剂为活性碳、皂土或硅酸盐 ；吸附剂的加入量为 3— 5g ／ 100mlNaCl 溶液量。