[发明专利]一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的分离纯化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的分离纯化方法及其应用，属 于生物工程技术领域。

背景技术

乙型肝炎(简称乙肝)疫苗已大规模使用愈20年，但乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)感染仍是最为严重的全球性健康问题之一。据世界卫生组织报道，全世界约20 亿人有现状或既往乙肝病毒感染标志，每年约有60万人死于HBV感染引起的肝衰竭、肝硬化 和肝细胞癌。我国乙肝病毒携带者超过1亿，现有患者超过2000万，南方流行重于北方，农村 重于城市。目前并无特异性治疗乙肝的药物，最有效的手段就是接种乙肝疫苗。

第一代乙肝疫苗为血源疫苗，采用无症状带毒者(HBsAg阳性)血浆为原料制备。由 于提取方法不同，所得成分也有差别，但均含提纯的22nm小颗粒乙型肝炎表面抗原。80年代 以来开始研制第二代乙肝疫苗，系将S基因编码的226个氨基酸产物装配而成的抗原颗粒， 采用基因工程方法在哺乳动物细胞和重组酵母中均能表达。重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母) 乙肝疫苗是最新一代基因工程乙肝疫苗，是继血源疫苗、酿酒酵母疫苗之后的第三代疫苗， 系国家863重大科技攻关成果，已有2000万名受种者验证了其安全性。对HBsAg阳性母亲所 生新生儿，本市已将母婴阻断率较高的重组(汉逊酵母)乙肝疫苗纳入免疫规划，在出生12 小时内给予免费接种；在本地的临床观察中，健康成人全程接种后1个月，97.46％的受种者 抗体阳转；全程接种后半年，59.8％的受种者抗体水平在1000mIU/mL以上，因而保护期更 长。按照世界卫生组织资料，不同乙肝疫苗的相对效力不以HBsAg含量来判断，10ug重组(汉 逊酵母)疫苗适用于任意年龄的易感人群，能提供全面高效持久的免疫保护屏障。免疫预防 为主，有效遏制乙肝的高流行状态，基因重组(汉逊酵母)技术为乙型肝炎的免疫预防提供 了一种全新的选择。

多形汉逊酵母(HansenulaPolymorpha)，又称作Pichiaaugusta，是当前公认的 最为理想的外源基因表达系统之一。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。 汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种(LodeboerA.M.，etal.，1985)：一种是在过氧化物 酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanoloxidase，MOX)作用下生成甲醛和H₂O₂，甲醛再经 甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase，FMD) 作用下生成CO₂，H₂O₂在过氧化氢酶(catalase，CAT)的作用下生成H₂O和O₂；甲醇的另一个代 谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖 类，其中二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetonesynthase，DHAS)是这一过程的关键酶。甲醇 代谢过程中的各种关键酶，包括MOX、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们 受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0.1％时，阻遏 作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80％，MOX和DHAS 可占细胞总蛋白的15％，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用 作外源基因在酵母中表达的常用启动子。汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生 物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵 母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵 母(PichiaPastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产 的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗 原的分离纯化方法及其应用，适用于规模化生产HBsAg重组蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用的一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗 原的方法，包括以下步骤：