[发明专利]一种白菜成熟花粉细胞荧光原位杂交的方法

说明书

本发明属于作物分子细胞遗传学技术领域，具体涉及一种白菜成熟花粉细胞荧光原位杂交的方法。该方法步骤包括白菜成熟花粉时期花蕾的确定、成熟花粉细胞制片、探针标记、原位杂交和信号检测等。本发明的特点是：取白菜开花前1‑2 d的花蕾，在50%冰醋酸溶液中分离出新鲜花粉粒，采用垂直压片法破碎花粉壁，释放出完整的营养细胞与生殖细胞；细胞标本经预处理后与变性探针在80℃共变性3 min，直接进行原位杂交，获得了信号清晰的荧光杂交图片，揭示出目标DNA在营养细胞和生殖细胞中的信号表现差异。本发明填补了十字花科芸薹属植物成熟花粉细胞荧光原位杂交技术空白，应用于白菜花粉发育的分子细胞遗传学研究中。

技术领域

本发明涉及一种白菜成熟花粉细胞荧光原位杂交方法，属于分子细胞遗传学技术领域。

背景技术

花粉（pollen）是开花植物有性生殖的执行者，不仅对作物育性调控和杂种优势的利用至关重要，而且是研究细胞分化发育机制的极好材料。花粉的发育包括小孢子发生（microsporogenesis）和雄配子体发生（male gametogenesis），小孢子发生是植物花药内的孢原细胞分化发育成花粉母细胞，然后经减数分裂形成单倍体小孢子；雄配子体发生是小孢子先通过1次不对称有丝分裂分化成1个大而松散的营养细胞和1个小而紧实的生殖细胞，随后营养细胞不再分裂，而生殖细胞再经1次正常的有丝分裂形成两个精细胞（雄配子），即形成成熟的花粉粒（雄配子体）。在花粉发育过程中，减数分裂使亲本2个体细胞基因组发生重组产生1个新的配子基因组，并在后来的有丝分裂过程中经历了程序化和自发性的变化，从而导致营养细胞和生殖细胞核遗传物质可能不同。近几年来，雄配子体遗传机制已经成为一个研究热点，利用不同的分子遗传技术及高通量组学技术，已发现一些调控雄配子体形成和花粉管生长的重要基因，也为营养细胞和生殖细胞的功能基因组特征研究提供了新的机遇。然而对于特异序列或基因在功能和命运完全不同的营养细胞与生殖细胞内表现差异的分子细胞遗传学研究极少。

荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization，FISH）是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，广泛应用于动植物细胞间期周期各个阶段的染色体或特异DNA序列的研究，涉及遗传作图、基因定位、染色体畸变检测、染色体重排、基因组结构和物种进化分析等许多方面。在植物上，花粉粒是一种唯一可接触的细胞类型，且为单倍体，处于G1期，无内源多倍化。在花粉细胞上进行FISH杂交，有助于我们直接观察一些特异重复或基因序列或染色体通是否过了花粉发育阶段，并确定在营养细胞和生殖细胞是否存在不同。目前这还是一个新的研究领域，尚无相关研究报道。此外，开展花粉细胞荧光原位杂交，还存在一项非常具有挑战性的工作，即花粉粒外包被有坚硬的完全干燥的花粉壁，如何去除花粉壁的阻碍，使花粉细胞完全平铺在载玻片上，以便探针能够穿过细胞质渗入到核染色体，是影响花粉细胞荧光原位杂交能否成功地关键。

发明内容

本发明提供一种白菜成熟花粉细胞荧光原位杂交的方法的目的，是针对白菜花粉粒含有坚硬的花粉壁、花粉细胞较难很好的平铺到载玻片上、探针不易渗入到花粉核、花粉细胞荧光原位杂交尚属空白等问题，该发明能利用制备的花粉细胞标本进行FISH杂交获得清晰的杂交信号图片，反映出目标序列在营养细胞和生殖细胞不同的杂交模式。本发明为白菜花粉发育的分子细胞遗传学研究奠定了基础。

本发明的基本原理是：花粉母细胞经减数分裂后形成单核小孢子，进一步经两次有丝分裂形成含1个大而松散的营养细胞和2个小而紧实的生殖细胞的成熟花粉（雄配子体）。在该过程中，减数分裂使亲本2个体细胞基因组发生重组产生1个新的单倍性配子基因组，并在有丝分裂过程中经历了程序化和自发的变化。通过花粉荧光原位杂交，可以揭示目标重复序列或特异基因是否在营养细胞和生殖细胞间存在差异，是否能够通过生殖细胞传递给后代。