[发明专利]超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺

权利要求书

1.一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺，其特征在于：工艺步骤为 ：

⑴在牛肠激酶催化亚基的基因 EKL 上构建突变体 EKLM，突变体 EKLM 的核苷酸序列；

⑵替换掉突变体 EKLM 中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列，EKLMO，EKLMO 的核苷酸序列；

⑶在 EKLMO 的 5` 末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列，在 EKLMO 的 3` 末端加入标 签序列，得到完整的表达基因片段；

⑷将上述表达基因片段克隆进入载体，构建得到高效表达载体，将其转入大肠杆菌 BL21，用 IPTG 诱导重组基因的表达 ；

⑸收集菌体，提纯目的蛋白。

2.根据权利要求 1 所述的超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺，其特征在于：所述 步骤⑶中标签序列为四个连续的组氨酸标签序列 HIS₄。

3.根据权利要求1 或2 所述的超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺，其特征在于：所述步骤⑸中提纯目的蛋白采用的是包涵体变复性方法。

4.根据权利要求 3 所述的超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺，其特征在于：所述包涵体变复性方法的步骤为：

①按照每 10g 菌体加入 30ml 比例加入到溶液 A 中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵体；所述溶液 A 为 50mM Tris，pH 7.0 ；

②利用溶液 B 清洗包涵体两次 ；溶液 B 为 50mM Tris，pH 7.0，500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 ；

③向包涵体中加入20 倍包涵体质量的溶液C，溶解24h ；溶液C 为7.5M 盐酸胍，pH 9.0， 50mM Tris，100mM 巯基乙醇 ；

④溶解 24h 后将溶液 pH 调整至 3.5，采用溶液 D 进行透析 ；透析完成后，高速离心去 掉沉淀，上清逐渐滴加到 10 倍上清体积的复性溶液 E 中；所述溶液 D 为 7.5M 盐酸胍，50mM Tris，pH 4.0 ；所述复性溶液 E 为 0.7M 精氨酸，pH 8.6，2mM 还原性谷胱甘肽，1mM EDTA ；

⑤复性 72h 后，采用溶液 F 对添加有上清的复性溶液 E 进行透析，透析完成后，高速离 心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液 F 为 20mM Tris，PH7.6，20mM NaCl，1mM CaCl₂。

5.根据权利要求 4 所述的超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺，其特征在于：通过包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的蛋白。