[发明专利]检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，属于免疫学领域。

背景技术

犬恶丝虫(亦称犬心丝虫)是心肺心丝虫病的病原体，主要寄生于温带、热带地区的家 养犬猫及野生哺乳动物体内。作为一种以蚊媒形式传播的人畜共患传染病病原，该虫可导致 人的犬恶丝虫病。此外，一些血清制品也可能会导致人的犬恶丝虫病。通常，狗作为犬恶丝 虫的天然宿主，其成虫大多寄生在狗的肺动脉和右心室，而其微丝蚴则分散与狗的血液循环 系统。患病狗常因感染少量虫体而不表现出病状，但是其血液中的微丝蚴或循环性犬恶丝虫 抗原却是目前诊断该病的主要依据；并且在一些没有微丝蚴的隐性感染情况下，抗原检测被 认为是最敏感的检测方法。因此鉴定和筛选一种犬恶丝虫特异的、敏感的分子诊断抗原将对 该虫病的防控奠定基础。

发明专利CN102798716公开了一种犬恶丝虫ELISA检测试剂盒及其制备方法，利用从犬 恶丝虫成虫cDNA表达文库中筛选出的与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白同源为88％的MTFP 基因，并在大肠杆菌质粒中表达获得的MTFP蛋白作为抗原，通过间接ELISA法检测犬的犬恶 丝虫感染。该方法可快速检测犬恶丝虫感染，但是，其灵敏度有待进一步的提高，特别是对 单一的雌虫或雄虫感染，其检测结果并不准确。

因此，亟需一种检测灵敏度高的ELISA检测试剂盒。

自肿瘤蛋白(TCTP)从小鼠埃利希腹水瘤细胞和红白血病细胞内被最次描述以来，该蛋 白已在不同的生物，如哺乳动物、植物、较低的真核生物和原核生物内被发现和报道。此外， 在寄生虫中，tctp基因还被发现存在于恶性疟原虫、约氏疟原虫、布氏锥虫、秀丽隐杆线虫、 马来丝虫及班氏丝虫体内。重要的是，由于丝虫肿瘤蛋白的钙结合特性和组胺释放功能，该 蛋白目前已被认定与犬恶丝虫的致病性以及其在宿主体内的存活息息相关。当前，相关研究 对于TCTP在寄生虫中的生理角色已有了详细了解，然而对于该蛋白质在丝虫寄生虫阶段是否 具有免疫原性仍知之甚少。有报道称在马来丝虫的微丝蚴和成虫体内均可检测到高水平的 TCTP蛋白质表；并且作为一种分泌蛋白，马来丝虫肿瘤蛋白(Bm-TCTPs)在其微丝蚴的分 泌、排泄物中含量丰富，可引起宿主免疫反应。鉴于上述研究结果，本发明的发明人推测丝 虫的TCTP同系物在丝虫病的检测上应该具有潜在免疫诊断价值。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒。

本发明检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，包括ELISA板、洗涤液、封被液、酶标 二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码 得到的蛋白，所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码得到的蛋白，所述Di-TCTP基因 序列如SEQIDNo.1所示；

所述洗涤液为PBST，所述PBST为磷酸盐吐温缓冲液；

所述封被液为3wt％牛血清蛋白；

所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG；

所述显色物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述终止液为2.5NH₂S0₄。

其中，所述Di-TCTP蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：

a、从犬恶丝虫中提取得到RNA，并将其逆转录成cDNA；

b、以cDNA为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物如SEQIDNo.2所示；所述下游引物如SEQIDNo.3所示；

c、将PCR扩增得到的产物连接到表达载体，得重组表达质粒；

d、将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，得融合蛋白，过柱纯化后，即得 Di-TCTP蛋白抗原。

进一步的，所述PCR扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下 游引物1μL，模板DNA1μL，ddH₂O9.5μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性35sec， 53.8℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；最后72℃延伸10min。

所述表达载体为pET-28a(+)。

本发明解决的第二个技术问题是提供检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，该方法可以 检测血清以及血清制品中是否存在犬恶丝虫。