[发明专利]利用CRISPR技术编辑CCR5基因的sgRNA序列及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术与基因治疗领域，尤其涉及利用CRISPR系统靶向敲除CCR5基因和治疗艾滋病的sgRNA序列及其用途。

背景技术

CRISPR/Cas系统是一种细菌和古细菌用于外源遗传物质的降解的适应性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点。这种新材料，也称为间隔区，建立用于将来对噬菌体感染性的序列特异性的片段。这些序列特异性的片段被翻译成引导CRISPR的RNA(sgRNAs)，其功能为经由CRISPR相关(Cas)蛋白的核酸酶活性，由CRISPR位点编码导向，互补侵入DNA裂解。II型CRISPR系统Cas9核酸酶具有RNA结合域，α螺旋识别叶(REC)，核酸叶，其中包括RuvC和HNH的DNA裂解和前间区序列邻近基序(PAM)交叉位点。sgRNA形成与Cas9核酸酶的复合通过结合到REC叶内桥螺旋，并形成多个具有sgRNA骨干的盐桥。

一旦sgRNA结合到Cas9，Cas9核酸酶的构象发生改变，产生一条能通道，让DNA更容易结合。Cas9/sgRNA复合体扫描DNA找到PAM(5'-NGG)位点。识别PAM位点导致DNA解旋，使sgRNA找到PAM位点相邻的DNA互补链。当Cas9结合到PAM位点相邻的，与sgRNA互补的DNA序列上，REC叶内部的桥螺旋和靶DNA形成RNA-DNA异源双链结构。PAM位点的识别包括可使靶DNA双链断裂(DSB)的HNH和RuvC核断裂的激活，和导致DNA降解。如果sgRNA与靶DNA不互补，Cas9将会释放出来，寻找新的PAM位点。DNA中的线性靶基因组断裂后可以通过非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导的修复(HDR)来进行修复。非同源末端接合(NHEJ)会引起插入或者删除错误。同源介导的修复(HDR)可在基因组的特异性位点结合特定标记。CRISPR/Cas9机制可用于包括哺乳动物细胞在内的各种系统的基因工程中。

如今，CRISPR/Cas9系统在基因治疗领域大放异彩，新近报道的利用CRISPR/Cas9系统对先天性肌营养不良的基因编辑为病人恢复正常的肌肉功能更是获得领域内的大量关注。在CRISPR/Cas9应用于临床的前景被一致看好的当下，越来越多的CRISPR/Cas9系统优化方案被提出。

近年来，艾滋病治疗研究取得了突破性进展。2007年，德国一个医疗小组将CCR5基因缺陷的造血干细胞移植给一名患有白血病的艾滋病患者。通过四年多的观察，病人HIV检测结果为阴性，不再有白血病和HIV感染迹象。这一案例的成功，提示CCR5是艾滋病治疗的理想靶点。以辅助受体为靶向的治疗策略为功能性治愈艾滋病提供了一种新思路。已有研究表明，通过基因修饰消除细胞表面CCR5的表达可达到抗HIV病毒感染的目的。

发明内容

本发明利用CRISPR技术针对CCR5靶点，设计并筛选获得了安全高效的sgRNA，其具有切割效率高，脱靶概率小等优点，在基因编辑效率和使用安全性方面具有最佳效果，并在艾滋病基因治疗的临床研究和应用上具有广泛的前景。所述位点也是基因治疗艾滋病的最佳sgRNA位点选择。

在一些实施方案中，本文提供针对CCR5基因的sgRNA序列，所述sgRNA序列选自：CCR5-sgRNA1：AGGGCAACTAAATACATTCT，CR5-sgRNA2：TGCCAAAAAATCAATGTGAA，CCR5-sgRNA3：AGTGGGACTTTGGAAATACA，和CCR5-sgRNA4：ATGCACAGGGTGGAACAAGA。

在一些实施方案中，本文提供编码所述sgRNA序列的DNA序列，例如5'-TCCCGTTGATTTATGTAAGA-3'，5'-ACGGTTTTTTAGTTACACTT-3'，5'-TCACCCTGAAACCTTTATGT-3'，5'-TACGTGTCCCACCTTGTTCT-3'。

在一些实施方案中，本文提供包含所述sgRNA序列或DNA序列的载体，如质粒。

在一些实施方案中，本文提供包含所述载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞。