[发明专利]人细胞系中重组人蛋白质的无血清稳定转染和生产

权利要求书

1.制备稳定转染了核酸序列的永生化人细胞系的方法，所述核酸序列包含编码人靶蛋白质或其衍生物或突变体的基因、启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化(多聚A)信号，所述启动子和多聚A信号分别与所述人靶蛋白质编码基因的5’和3’末端连接，所述方法包括在无血清条件下使用包含所述核酸序列和复制起点的转染载体转染永生化人宿主细胞系。

2.权利要求1的方法，其中所述人靶蛋白质是人血浆蛋白质，其选自凝血因子例如因子IX、因子VIII(野生型和B结构域缺失的)、因子VII/VIIa和血友病因子(vWF)；生长因子例如红细胞生成素等；集落刺激因子(CSF)例如粒细胞刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)和粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)；细胞因子例如白介素；蛋白酶抑制剂例如α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和糜蛋白酶；转运蛋白例如激素；抑制或调节作用蛋白；及其衍生物和突变体，优选地，所述人蛋白质选自因子IX、因子VIII(包括野生型因子VIII和B结构域缺失的因子VIII)、因子VII/VIIa、G-CSF、vWF和A1AT，最优选地，所述人蛋白质是如SEQIDNO:1的939-2324位碱基对所编码的凝血因子IX、如SEQIDNO:2的973-2259位碱基对所编码的人A1AT、如SEQIDNO:9中所示的野生型因子VIII、如SEQIDNO:3的783-5162位碱基对所编码的B结构域缺失的人因子VIII、如SEQIDNO：13和14所编码的因子VII/VIIa、如SEQIDNO：15、16和17中所编码的G-CSF或者如SEQIDNO：18所编码的vWF。

3.权利要求1或2的方法，其中在所述转染载体中，

(i)启动子选自病毒启动子、看家基因启动子和组织特异性启动子，优选地，所述启动子是带有或不带内含子A的CMV启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、HSVTK启动子等，最优选地，所述启动子是CMV启动子；和/或

(ii)复制起点允许所述质粒在细菌中复制和扩增；

(iii)所述载体还带有至少一个选择标记基因，优选所述选择标记选自潮霉素抗性、新霉素抗性、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)抗性、博来霉素(phleo、bleo、zeocin)抗性和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT、gpt)抗性，和/或所述基因处于如上文(i)中定义的启动子的控制下；和/或

(iv)所述载体还带有一个或多个其他调节元件，所述调节元件优选选自剪接位点、重组位点、多聚A位点、增强子、多克隆位点和原核质粒序列。

4.权利要求3的方法，其中所述转染载体带有CMV启动子、潮霉素基因、多聚A序列和目的基因，并优选来源于具有SEQIDNO:4或5所示序列的pcDNA3.1载体。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述永生化人细胞系

(i)能够在无血清条件下转染和培养；和/或

(ii)已在其基因组中整合了腺病毒序列；和/或

(iii)选自肾、膀胱、肝、肺、心肌、平滑肌、卵巢和胃肠细胞，优选人肾细胞系；和/或

(iv)不能表达人朊病毒蛋白。

6.根据权利要求5的方法，其中所述肾细胞是人胚肾细胞，优选地，所述人胚肾细胞选自293细胞(ATCCCRL-1573；DSMACC305)、293T细胞(DSMACC2494)、FreeStyle293细胞(293F细胞；InvitrogenR79007)，优选为293F细胞(InvitrogenR79007)。

7.权利要求6的方法，其中所述细胞系是293F，所述转染载体来源于pcDNA3.1，所述载体优选编码如SEQIDNO:1的939-2324位碱基对所示的人凝血因子IX、如SEQIDNO:2的973-2259位碱基对所编码的人A1AT、如SEQIDNO:9中所示的野生型人因子VIII，或者如SEQIDNO:3所示的B结构域缺失的人因子VIII、FVII/FVIIa、G-CSF、包括SEQIDNO：27中所示的G-CSFb，或者血友病因子。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述无血清转染在无血清的悬浮培养物中使用阳离子转染试剂或磷酸钙进行，优选使用脂转染胺2000CD试剂(Invitrogen)。