[发明专利]一种应用发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种应用发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E 的系统及方法。

背景技术

多粘菌素E具有较好抗菌谱、高效、低毒、残留少的特性，可用于饲料添加剂，促进禽 兽生长，提高饲料利用率，并且可以防止饲料在大规模生产中常出现的由大肠埃希氏菌和沙 门氏菌污染引起的疾病，我国已将多粘菌素E列为国家法定品种，但产品效价较低，主要依 靠进口。本产品主要由发酵法制得，传统的分离方法主要用离子交换色谱，这一过程的能耗 很大。本课题组采用泡沫分离的方法分离发酵液中的多粘菌素E已发表专利，首先发酵液预 处理，真空干燥，喷雾干燥继而得到多粘菌素E的浓缩液，浓缩倍数达到15，收率为95％， 具有广阔以及实用的经济效果。

但这种方法在发酵过程中随着产物的增加会造成严重的抑制作用，使得发酵液中多粘菌 素E的总效价较低。对于这一现象目前已有文献采用泡沫分离的方法，在发酵罐底部装有气 泡分布器，通过鼓泡分离目的产物，这种方法可以有效的消除产物抑制作用，提高产率，比 传统方法有很大的进步，但是在泡沫分离过程中，随着泡沫相的上升会带走部分营养物质和 细胞，降低原料利用率，降低富集比，同时由于在充当反应器的发酵罐中进行分离产生大量 气泡会影响传质。

发明内容

当前技术中存在的多粘菌素E主要由发酵法制得，但是在发酵过程中随着产物多粘菌素 E的增加会造成严重的产物抑制作用的不足；而目前已经有应用泡沫分离的方法在线分离产 物，并在发酵与泡沫分离耦合制备乳链菌肽取得成功。但由于是罐内耦合有很多的局限性， 一方面对于操作条件既要满足发酵的最佳条件又要符合分离的要求；另一方面随着气泡的产 生不止带走了产物而且会将营养物质带出。基于以上局限，本发明提供一种应用发酵与泡沫 分离耦合生产多粘菌素E的工艺方法和装置。该方法提出将发酵、膜分离与泡沫分离耦合通 过蠕动泵构成循环回流装置制备多粘菌素E。在耦合操作时，利用蠕动泵将发酵液通过膜过 滤器进入泡沫分离塔，产物和液体通过膜而细胞被截留在发酵罐中继续发酵，保证了菌体的 恒定；在泡沫分离塔底部装有气泡分布器，通过鼓气产生气泡进行泡沫分离，由于通过膜过 滤器部分营养物质进入泡沫分离塔，所以本发明采用的是循环回流的方式将泡沫分离后的余 液回流回发酵罐中，保证了营养物质的充分利用；同时本发明采用罐体外耦合，发酵的操作 条件和泡沫分离的操作条件分别控制，都可以满足最佳的操作条件。

本发明采用的技术方案是：

一种微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征在于，包括如下步 骤：

a)菌种活化：将从冷冻甘油管中得到的多粘芽孢杆菌菌液，接种于斜面培养基中进行活 化，30℃，培养65～75h；

b)种子培养：将活化后的菌种接种到含种子培养基的种子瓶中，在32℃培养24h，得到 种子液，准备进入微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的联合装置进行下一步骤；

c)发酵培养：将上步得到的种子液以10％的接种量首先接种到装有发酵培养基的发酵罐 中，培养温度30-35℃、搅拌转速100-400r/min、通气量100-300mL/min，多粘芽孢杆菌在发 酵培养基中发酵培养得到富含多粘菌素E的发酵液；培养基装液量为发酵罐容积的60～85％；

d)微孔滤膜过滤：多粘芽孢杆菌在发酵罐中发酵培养，发酵30-40h后，启动发酵罐内 部的膜过滤器，发酵液中的产物分子和部分培养基通过膜过滤器，通过蠕动泵以100-300mL/h 的速度进入发酵罐外部的泡沫分离塔中，生物细胞被截留在发酵罐内继续发酵；

e)泡沫分离：分离塔内的液体体积累积到塔体积的25～40％后，开启分离系统进行泡沫 分离，其中，通气量为50-150mL/min，温度为30-35℃，顶部接收液体形成多粘菌素E的浓 缩液，而后为保持分离塔的装液量不变，开启回流阀将富有营养物质的泡沫分离余液回流进 入发酵罐中，循环进行，直至发酵结束。

所述的发酵罐和分离塔均通入无菌空气。

所述的膜过滤器中使用的微孔滤膜材料为0.45μm的纤维素无机膜。

所述的步骤(a)中多粘芽孢杆菌的斜面培养基的组成及制备方法包括：葡萄糖10g/L， 酵母粉10g/L，蛋白胨1g/L，氯化钠1g/L，琼脂15g/L，氨水调节pH到7，115-121℃高压蒸 汽灭菌15-30min；