[发明专利]一种结核分枝杆菌蛋白HBHA及其表达方法和亚单位疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌蛋白HBHA及 其表达方法和亚单位疫苗。

背景技术

肝素结合血凝素(HBHA)是M.tb、BCG、麻风分枝杆菌(M.leprae)等 表面表达和分泌的一种糖蛋白，可同时出现在菌体和培养液中。HBHA能够粘 附到上皮细胞和其他非吞噬细胞，有利于M.tb从初次感染部位的体内扩散。

翻译后修饰对HBHA蛋白的免疫原性有重要影响。天然HBHA免疫小鼠后， 不但能诱导小鼠产生高水平IFN-γ和抗体，并且能够有效减少感染小鼠的脾、肺 脏荷菌量和病理改变，其产生的免疫效果甚可达到BCG的相应水平。鉴于天然 HBHA在预防结核病方面的重要作用，需要对其进行大规模的纯化制备以备进 一步的进行临床研究应用。但是大规模的纯化制备受表达系统的制约，如大肠 杆菌表达系统表达的蛋白HBHA不能进行翻译后修饰，耻垢分枝杆菌表达的蛋 白HBHA不适宜大规模生产等。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种毕赤酵母GS115 表达的结核分枝杆菌蛋白HBHA及亚单位疫苗，其目的在于获取不含有除蛋白 HBHA本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白HBHA，并对 其进行大规模的纯化制备以备进一步的进行临床研究应用，配合本发明提供的 疫苗佐剂，用于预防结核病，由此解决了大规模的纯化制备受表达系统的制约 的问题。

本发明首先提供一种肝素结合血凝素蛋白(HBHA)，包含有：

1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白质；

2)与序列SEQIDNO:1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同 功能蛋白质的氨基酸序列。

上述蛋白质的表达方法，是将核苷酸序列为SEQIDNO:2的基因的的第267 碱基由原先的G突变为A；再将突变后的基因片段插入到毕赤酵母表达载体中， 构成的重组质粒转入毕赤酵母中进行表达，纯化后获得目的蛋白。

本发明另一个方面提供一种结核病亚单位疫苗，含有所述的HBHA蛋白和 疫苗佐剂；其中HBHA蛋白的浓度为0.25～0.75mg/mL：

所述的亚单位疫苗中脂质体形式的DTM疫苗佐剂的使用浓度如下：0.5～2 mg/ml二甲基双十八烷基铵、含有0.25～0.75mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL 的单磷酰脂质A；

所述的亚单位疫苗中溶液形式的PTM疫苗佐剂的使用浓度如下：0.25～0.75 mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL的单磷酰脂质A，12.5～37.5mg/mL的聚 乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。

本发明选利用毕赤酵母GS115菌株能够表达出的蛋白HBHA无标签且不含 有除HBHA本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列，配合相应疫苗佐剂能够取得 下列较好的免疫反应效果，免疫保护效果和高安全性。

附图说明

图1：实施例4的PCR鉴定HBHA基因整合于毕赤酵母GS115染色体基因 组和蛋白HBHA的表达纯化图；

图2：实施例9的各组小鼠血清蛋白HBHA特异的IgG抗体、亚类及 IgG2a/IgG1比值图；

图3：实施例9的蛋白HBHA特异的小鼠脾细胞上清中细胞因子IFN-γ水 平图。

图4为实施例10的气溶胶攻击感染免疫C57BL/6小鼠四周后各组的肺脏荷 菌量图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施 方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的毕赤酵母GS115表达的蛋白HBHA无标签且不含有除HBHA 本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列。本发明提供的结核病亚单位疫苗，含有 所述的蛋白HBHA，其浓度为0.25至0.75mg/mL，还含有以下两组成分中的一 组的：

0.5mg/ml至2mg/ml二甲基双十八烷基铵、含有0.25至0.75mg/mL的海 藻糖，0.25至0.75mg/mL的单磷酰脂质A，为脂质体形式；