[发明专利]检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法，本发明属于基因检测技术，扩增引物利用F8基因的序列信息设计65对PCR引物，通过PCR靶向扩增F8基因目标区域，扩增区域覆盖F8基因外显子编码区的99.5%。所述方法将多重PCR靶向扩增结合Ion torrent PGM高通量测序技术，实现多个样品的同时并行检测，提高了F8基因突变的检测范围和通量，缩短了检测周期，降低成本。

技术领域

本发明属于体外基因检测领域，尤其涉及一种检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法

背景技术

血友病（hemophilia）是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，患者由于凝血因子基因突变而导致凝血因子浓度下降或缺乏，从而造成凝血时间延长、轻微创伤后有出血倾向性。根据缺乏凝血因子的不同，临床上分为血友病A（hemophilia A, HA）和血友病B（hemophilia B, HB）。其临床表现主要为自发性、轻微外伤后出血难止或创伤、手术后严重出血等。出血的部位常见于负重的大关节（如膝、肘、踝、腕、髂、肩等）和肌肉/ 软组织，也可表现为内脏出血（如腹腔内、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等）、皮肤、黏膜出血（如皮肤淤血、鼻出血、口腔出血、牙龈出血等）。由于凝血因子Ⅷ( Ⅷ因子) 和凝血因子Ⅸ( Ⅸ因子) 的编码基因位于X 染色体上，因此大多数血友病患者分布于男性，男性人群中血友病A 和B的发病率分别约为1 /5 000 和1 /30 000。其中，血友病A（hemophilia A, HA）是最常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，由于FVIII的遗传性缺陷或缺乏所致，从而引起凝血功能障碍，发病率在男性中约为1/5 000，女性通常为携带者，约60%患者有遗传病家族史。患者常常发生自发性或者外伤后出血不止，反复关节出血往往导致关节畸形，重要脏器出血可危及生命，目前尚无有效的根治方法，患者主要输注FVIII制品或新鲜全血预防和治疗出血。由于HA的危害性、遗传性及终生性，有必要开展HA的基因检测，为临床干预和遗传咨询提供依据。遗传学研究表明血友病A主要由F8基因突变引起；该基因位于X性染色体长臂末端（(Xq28, chrX: 154,064,070- 154,250,998, in hg19），其长度约有186kb并转录形成大约9kb的mRNA；该基因含有26个外显子（exon），各外显子的大小不一，范围在69bp至3106bp之间。F8基因结构复杂，突变种类多，包括基因点突变、缺失、插入和倒位等，可能涉及整个基因，几乎覆盖了所有外显子的区域，因此特异性检测F8基因突变较为困难。很多年来，F8基因的复杂性导致很难对F8基因进行有效地突变分析。直到1991年，Higuchi等人首次使用变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以分析F8基因的整个编码区，在29个轻度或中度血友病A患者（包括15名德国人和14名日本人）中发现25名（86%）患者F8基因致病突变，而在重度血友病A患者中仅发现53%的患者F8基因致病突变。在1998年，Liu等首先基于LD-PCR技术建立了Inv22突变检测方法，随后Bagnall等在2002年基于LD-PCR技术建立了Inv1突变检测方法，这两种方法一直沿用至今。随后，多种突变筛查方法，如单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、构象敏感凝胶电泳（conformation sensitive gel electrophoresis）、DGGE 和化学裂解错配（chemical cleavage mismatch）分析方法，被使用于许多实验室。但这些分析方法仍只能检出的血友病A患者中80-90%的F8基因突变。对F8基因的直接测序（PCR扩增+Sanger测序），并且针对血友病A患者的F8基因突变检出率可达97%。最近几年随着二代测序技术的发展，二代测序技术也逐渐在各实验室使用并应用于血液疾病的遗传检测分析。目前，对PCR产物进行直接Sanger测序是常用的F8基因检测方法，虽然该方法更为准确，但测序工作量巨大、效率低，对操作人员要求较高，限制了该方法的大规模临床应用，仅能在有条件的实验室开展。