[发明专利]铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白Vac11的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及铜绿假单胞菌(PA)重组蛋白Vac11 (AmpDh3)的分离纯化方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，广泛分布于 自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，感染可发生在人体任何部位和组织， 该菌目前已成为ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，全身感 染死亡率在20％以上。

目前在PA疫苗方面已开展了广泛研究，但普遍存在抗原类型单一、免疫保 护效果低下等问题，尚无一种疫苗进入临床应用。AmpDh3是铜绿假单胞菌的典 型锌蛋白酶，其位于细菌的周浆间隙，在细菌细胞壁的形成和重构 (re-modeling)过程中发挥重要作用(LeeM等，JAmChemSoc.2013)。此 外，AmpDh3基因的缺失会导致铜绿假单胞菌细菌的毒力明显下降(MoyaB,等 AntimicrobAgentsChemother.2008)。鉴于AmpDh3在铜绿假单胞菌生理和致 病过程中的重要作用，其可以作为重组基因工程亚单位疫苗的重要候选抗原。

申请人采用基因工程技术克隆通过大肠杆菌基因工程菌表达获得铜绿假单 胞菌(PA)疫苗重组蛋白Vac11(AmpDh3)，所述重组蛋白经动物试验证明，可 有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用，有利于铜绿假 单胞菌的预防、诊和治疗。目前，尚未见针对该重组蛋白Vac11的纯化方法的 报道。

发明内容

本发明的目的：提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vac11 疫苗的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复 性好，回收率较好。

本发明的技术方案是：

铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vac11，其核酸序列如SEQ IDNO：1所示、氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vac11的纯化方法。包括 步骤：收集制备的所述抗原Vac11；按照高压破菌、离心；GST亲和纯化；QHP 层析纯化；QHP层析纯化；G25层析纯化；QHP层析纯化的顺序组合对制备的 抗原进行纯化。

上述纯化方法的具体步骤如下：

1)高压破菌

收集的菌体用pH为7.0-7.5的10mMPB缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压 匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2)GST亲和纯化

GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A液对目标蛋白进行纯化， PrescissionProtease酶进行酶切洗脱：

3)QHP层析纯化

将经步骤2)纯化的目标蛋白，使用A平衡层析系统及QHP层析柱，B液 线性梯度洗脱；

4)G25层析纯化

将经步骤3)纯化的目标蛋白，使用G25层析柱纯化，采用C液平衡层析 系统及层析柱，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液；

5)QHP层析纯化

将经步骤4)纯化的目标蛋白，加入0.1％TritonX-100混匀，采用D液平 衡层析系统及QHP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，分离纯化目 标蛋白；

其中，A液为pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄的缓冲溶液，B液为 pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，1MNaCl，C液为pH6.0的10mMHis，0.25M NaCl，D液为pH6.0的10mMHis，0.25MNaCl，0.1％TritonX-100。

步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60-80MPa，高速离心获取破菌上清。

步骤2)所述的GST亲和层析使用的填料为GlutathioneSepharose4B或 GlutathioneSepharose4FF或GlutathioneSepharoseHP。

步骤2)所述的PrescissionProtease酶带有GST标签。

步骤3)所述的QHP层析柱的填料为QSepharoseHP或QSepharoseFF 或CaptoQ。