[发明专利]一种人外泌体蛋白、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，尤其涉及一种外泌体Dicer蛋白及其应用，具体地为一种可用于肺癌早期检测及术后监测的以外泌体Dicer蛋白为肿瘤标志物的ELISA( 酶联免疫吸附测定法) 试剂盒的制备及应用。

背景技术

近年来，肺癌成为威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤首位，且发病率逐年增高。肺癌的5年存活率仅为13%，80%的患者在诊断后1年内死亡。肺癌的早期诊断率仅15%，但这些患者的5年存活率可达60%～90%。以上可见，诊断肺癌、控制肺癌是摆在医务工作者面前紧迫而艰巨的任务。临床上传统的肺癌诊断方法有胸部 X线片、支气管镜检查、痰液细胞涂片等，因其症状、体征均无特异性，与其它肺部疾病，如肺炎，肺结核等病难以鉴别。因其特异度和灵敏度有限，大多数患者发现时已是晚期。肿瘤标志物相比于其他传统诊断方法具有更高的特异度和灵敏度，也越来越得到广泛应用。

随着肿瘤病理学、分子生物学研究的进展，血浆肿瘤标志物的研究与筛选成为肺癌早期诊断的研究热点。理想的肿瘤标志物应该是敏感性高，特异性强，表达量或血浆中水平与肿瘤组织扩散或肿块大小成正相关。目前临床常用的肺癌肿瘤标志物包括：CEA（癌胚抗原）、CYFRA21-1（细胞角蛋白19的可溶性片段）、SCC（鳞状细胞癌抗原）、NSE（神经元特异性烯醇化酶）和ProGRP（胃泌素释放肽前体）。癌胚抗原CEA是一种具有人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白，它是一种肿瘤相关抗原，存在于多种肿瘤组织中，其在肺腺癌中有较高的诊断价值，特异性在90%以上时，敏感性可达50%-70%，也是临床上应用最为广泛的一种。由于肺癌发病机理较复杂，致病的分子生物学基础因个体差异也表现出多样性，这也使得单一的分子标记物并不能有效指示肺癌发病的早期差异或者预后的个体特征。因此发现并开发能兼顾敏感性和特异性的血浆肿瘤标志物，应用于肺癌的临床检测，以期达到肺癌早期诊断、术后监测及预后评估的目在肺癌的临床应用中显得十分必要。

外泌体(Exosome)在30年前被人们所发现。外泌体是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/mL的小囊泡。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体 )的膜性囊泡。外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息。而不同组织细胞来源外泌体由于携带的蛋白质不同，则能够发挥不同的生物学功能。外泌体通过与受体细胞相融在细胞间通信过程中起关键作用。因此这些外泌体内的蛋白及RNA等被证实对于多种生理学事件均发挥了巨大的调控作用，被认为是潜在的生物标志物或治疗试剂。

酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA) 是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。它是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。同时，由于ELISA 的技术条件要求低、携带方便、常以试剂盒的形式出现且易商品化、操作简便和经济实惠，已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。基于ELISA的双抗体夹心法是检测抗原的最常用的方法。

Dicer酶是一种核糖核酸内切酶，属于RNase III家族中特异识别双链RNA的一员。Dicer蛋白有着较多的结构域，包含一个RNA解旋酶基序如位于氨基端的DEXH盒子，和一个位于羧基端的RNase基序。它最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。编码人类Dicer蛋白的基因定位于染色体14q32.13。Dicer蛋白在大脑、心脏、肝脏、肺、胰腺、肾脏及胎盘等器官中均广泛表达，并且在RNA干扰通路中发挥作用。它能以一种ATP依赖的方式逐步切割包括miRNA前体等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(dsRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。单链miRNA前体经过Dicer加工后可成熟为长度为20-24个核苷酸的miRNA。Dicer蛋白位于哺乳动物的细胞质中，通常它与钙网蛋白共定位于内质网。Dicer蛋白的分子大小为218kDa。