[发明专利]CLCA2蛋白在人宫颈癌siha细胞中表达的检测方法及应用

权利要求书

1.CLCA2蛋白在人宫颈癌siha细胞中表达的检测方法，其特征在于，包括以下的具体步 骤：

(1)利用基因芯片实验检测不同浓度的异喹啉类生物碱异紫堇碱对HPV16Siha细胞处 理后差异基因表达谱的改变；以干燥秃疮花为原料，利用乙醇提取法和硅胶柱色谱分离法 进行异喹啉类生物碱的提取和异紫堇碱的分离，得到异紫堇碱，SiHa细胞株生长到对数生 长期，密度达80％时用浓度为800μmol/L的异紫堇碱处理，将样本分为四组，分别是：①未经 异紫堇碱处理的SiHa细胞，②经异紫堇碱处理12小时后的SiHa细胞，③经异紫堇碱处理24 小时后的SiHa细胞，④经异紫堇碱处理48小时后的SiHa细胞，分别以Trizol法裂解后收集 样品，采用HumanTranscriptomeArray2.0表达谱芯片筛选表达差异的 mRNA；

(2)利用RT-PCR法检测药物干预前后细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直 接克隆及特定基因的cDNA序列；以5000个/孔将细胞种进96孔板中，培养24h后，弃去旧培养 液，加入浓度为800μmol/L的异紫堇定碱干预，分别培养12h，24h，48h，用BioTeke的RNA提取 试剂盒抽提总RNA，首先，用枪头吸尽培养基，向各孔中加入125μl*2的Buffer，再用枪头吸 尽CellAmpTMWashingBuffer，后向各孔中加50μl的Processing溶液，反复吹打 Processing液后，移至微量离心管中，75℃水浴5min，分装得到的细胞裂解液，以便后续反 转录实验，同时每组均设定复孔；5μgRNA被反转录成cDNA10μl体系，其反转录体系包括：5 ×PrimeScriptTMBuffer2μl，PrimeScriptTMRTEnzymeMixI0.5μl，50μMOligodT Primer0.5μl，Random6mers0.5μl，RNaseFreedH2O4.5μl，cDNA2μl，反转录条件37 ℃、15min，85℃、5秒，再以cDNA为模板进行特异性扩增，其扩增反应20μl体系由：Tap酶10μ l，Forwardprimer0.4μl，Reverseprimer0.4μl，Rox0.4μl，ddH₂O6.8μl，and2μlcDNA 模板组成，需要扩增目的基因的引物序列和退火温度由Tablel给出，β-actin被扩增作为对 照，荧光实时PCR反应结束后，由系统分析软件确定阈值，进而确定各反应样本的CT值，采用 相对定量的2-ΔΔCT法分析PCR结果，确定各样本之间基因的表达差异；

公式：ΔCT＝(CTTarget-CTActin)

ΔΔCT＝(CTTarget-CTActin)Timex-(CTTarget-CTActin)TimeO

2-ΔΔCT表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

表1引物及扩增产物的大小

(3)通过WesternBlot法观察HPV病毒致瘤基因E6蛋白表达的变化；细胞总蛋白以RIPA 裂解液提取，蛋白定量依据Bradfordsmethod以BSA作为标准对照，在570nm波长处测其吸 光度值，计算样品中的蛋白含量后将每个样本以RIPA液稀释为5μg/μl，每个样本80μl的总 蛋白与20μl蛋白上样缓冲液混匀后置于100℃沸水煮10min进行变性，蛋白电泳用80V跑浓 缩胶，120V跑分离胶，每个泳道上样量为40μg/20μl，转膜采用0.45μmPVDF膜，100V恒压，4 ℃，1.5h，转完膜后用TBST将膜浸洗一次，放入5％脱脂奶粉-TBST缓冲液中25℃摇床封闭 1h，封闭完全后，按1∶500稀释比加入兔抗人CLCA2一抗，4℃摇床慢速震荡孵育12h，以TBST 缓冲液漂洗后将膜放入按1∶10000稀释好的山羊抗兔二抗杂交液体中25℃摇床孵育2h，蛋 白条带用ECL发光液进行显像，最后用X线暗盒曝光成像，蛋白条带判定由预染分子量的 Marker提供参考，利用Image-proplus6.0软件来分析各条带的OD值。

2.CLCA2蛋白在制备预防和治疗宫颈癌的药物组合物中的应用。