[发明专利]一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌及合成3‑羟基丙酸中的应用，所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因gdrA、α‑酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh和甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1导入宿主菌中构建而成；通过利用基因敲除技术降低副产物1,3‑丙二醇产量的同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD⁺，从而提高3‑羟基丙酸的产量，提高15倍。

(一)技术领域

本发明涉及一种3-羟基丙酸的制备方法，特别涉及一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其制备方法和应用。

(二)背景技术

纵观世界经济发展，以石油为基础的化石能源起到了功不可没的作用，但随着化石能源日益枯竭、全球油价不断飙升、环境污染日趋严重等问题的出现，许多国家都更加重视对可再生能源、环保能源以及新型能源的开发与研究；同时随着人类科学技术的不断进步，通过不断开发新型化学、生物方法，将使以生物资源为基础的生物加工过程替代传统化学工业成为可能。因此，从化石经济向生物经济过渡，由生物基原料代替石油基原料生产化工原料，是社会经济发展的必然趋势。

近年来，生物柴油作为一种极具发展前景的生物资源得到了快速的发展，而在此过程中，每生产10吨生物柴油就会产生1吨甘油，这不可避免地造成了市场上廉价甘油的过剩，因此，加快甘油下游产品开发的基础研究迫在眉睫。为了解决这一问题，业界兴起了以甘油为原料生产其他化学品的热潮，当前利用甘油的有效途径包括：生产乙醇，制备1,3-丙二醇，合成环氧氯丙烷，生产乙二醇，生产乳酸，合成二羟基丙酮等。研发甘油的革新用途，建立其下游化学品开发利用的有效途径，降低生物柴油生产成本，提高资源利用率成为这一新兴能源产业面临的巨大挑战，也是科学家们不断探索的新问题。

3-羟基丙酸(3-HP)是一种三碳无手性有机酸，与乳酸是同分异构体，可与水、醇、醚等多种有机溶剂互溶。其性质较为活泼，工业上可以用来合成很多重要的化工产品，如脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇发生酯化作用生成酯，还可通过还原作用生成1,3-丙二醇等。另外，还可用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品等。鉴于3-HP在商业上的重大开发价值，2004年，美国能源部也将3-HP列为当前世界上12中最具开发潜力的化工产品之一。因此，以甘油为原料生物合成3-羟基丙酸的研究有望成为甘油下游产品开发的另一个具有重要价值的新途径。

3-HP的合成方法大致可分为化学合成法和生物合成法两大类。目前，3-HP的制备主要依靠化学法，即将邻卤代醇与氰化钾作用生成的3-羟基丙腈进行水解或通过Reformatsky反应来制备3-HP。此外，将丙烯酸催化水解也可得到3-HP，这是市场上3-HP的主要来源。然而由于丙烯酸和丙烯腈易燃，且工艺需高温操作，故化学合成法的安全性较低、对设备的要求也较高。同时，由于丙烯酸的原料来源限制，该方法生产的3-HP已经远不能满足市场的需求，这在很大程度上限制了3-HP化学合成技术的发展，并且导致了3-HP的价格高居不下，目前3-HP的国内市场售价高达8.5万元/吨，这也进一步阻碍了其下游产品的开发利用。与之相反，以甘油为原料采用生物合成法生产3-HP不但可以有效利用生物柴油生产过程中产生的大量副产物，延伸生物柴油产业链，还能有效降低3-HP的生产成本，加快其工业化应用的进程。

生物合成法合成3-HP包括两种方法：(1)采用野生菌株；(2)构建基因工程菌株。早在1962年就有通过微生物直接发酵合成3-HP的报道，然而接下来却长期处于实验室研究当中，并没有大规模生产。随着基因工程技术的发展，构建基因工程菌株生产3-HP，提高3-HP的产量，已经成为现在研究的热点。目前，按照利用底物不同的所构建的基因工程菌有两种：

A.以葡萄糖为底物