[发明专利]一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的引物组合及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的引物及其试剂盒，属于分子生 物学检测技术领域。

背景技术

根据世界肿瘤研究治疗领域权威机构NCCN推荐，肺癌患者，尤其是非小细胞肺癌 (NSCLC)患者，建议进行EGFR基因突变检测。EGFR激活突变的存在对选择治疗用抗癌 药物具有重要作用。而研究表明，EGFR的某些突变，尤其是它的19号外显子缺失突变，21 号外显子点突变(L858R)，18号外显子点突变，20号外显子的点突变(T790M)，与络氨酸 激酶抑制剂(TKIs)的疗效有高度的相关性。此外，在部分肺癌病人当中，同时存在着EGFR 基因和KRAS基因的突变，而KRAS基因第2，3，4号外显子上的突变与络氨酸激酶抑制剂 (TKIs)的疗效有负相关作用，当KRAS基因存在这些类型突变时，会对靶向EGFR的靶向 抗癌药物产生抵抗。同时，BRAF基因在肺癌当中也存在不同程度的突变。这些突变中最主 要的是第1799位核苷酸上的突变，导致缬氨酸突变成谷氨酸(V600E)，使患者对抗体类药 物(如西妥昔单抗)产生抗药性。因此，检测EGFR、BRAF、KRAS基因的突变情况对指导 临床肿瘤用药具有重要作用。

在检测人组织细胞样本中EGFR、KRAS、BRAF基因突变的现有技术中，通常采用探针 技术对上述基因突变进行检测(如厦门艾德生物医药科技有限公司生产的EGFR基因检测试 剂盒)。采用荧光探针技术虽然能够提高检测的特异性，但是使用成本过高，同时无法检测新 型突变。另外采用荧光探针，通过突变组探针荧光起峰的Ct值大小进行判断的方法，其缺陷 在于没有有效参照物，虽然引入了内参，但是内参与突变位点并不是同一位点，甚至不是同 一种基因。而且，其Ct值的判断规则基于经验值，因此在检测时由于样本提取质量等因素， 其检测效果并不理想，在实际应用中，可能会出现检测结果的不一致。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的 引物试剂盒。本发明的试剂盒采用ARMS-PCR技术对上述基因突变进行检测，在ARMS-PCR 技术中采用SYBR荧光方法，能够大幅降低成本；同时通过优化引物设计，在荧光收集阶段 引入四步法(81℃收集荧光)，采用高性能的DNA聚合酶，最大限度减少非特异干扰，提高 检测的可靠性和准确性。

此外，本发明的试剂盒还引入了双内参系统，提供了双重判读规则，提高了检测的准确 性和灵敏度。

本发明中，所述EGFR、KRAS、BRAF基因突变的突变位点信息如下：

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引 物，所述ARMS引物的序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.31所示。

上述ARMS引物中，对于EGFR、KRAS和BRAF基因每一突变位点的检测都包括有3 条引物，其中：一条用于扩增正常位点，一条用于扩增突变位点，一条作为共用引物。

上述ARMS引物在制备检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒中的应用也是 本发明的保护范围。

根据本发明的第二方面，提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒，包 括：上述用于检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物和用于扩增第一内参的 引物；

所述第一内参为GAPDH基因，用于扩增第一内参的引物序列如SEQIDNO.32和SEQID NO.33所示。

所述ARMS引物中，用于扩增正常位点的引物和共用引物扩增得到对应突变位点的正常 基因位点，作为第二内参。

上述试剂盒中，还包括如下试剂：DNA聚合酶、10×DNA聚合酶缓冲液、SYBR-Green-I、 高纯水、阳性对照品和4种dNTP混合物。

优选的，所述DNA聚合酶为TaqHSDNA聚合酶。

进一步的，上述试剂盒中还包括用于对样品进行桑格测序的试剂，所述试剂中包含用于 扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一个、两个或全部的一个或多个外显子区域的扩增 引物对。

其中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的扩增引物对如SEQIDNO.34和SEQID NO.35所示；