[发明专利]一种密毛小花苣苔组培叶片两步成苗方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种密毛小花苣苔组培叶片两步成苗方法。

背景技术

密毛小花苣苔为苦苣苔科小花苣苔属植物，多年生小草本，根状茎圆柱形近垂直，叶片草质形状心状卵形或心形，有花，花期4月。中国特有珍稀植物，特产广西柳江，生于石灰岩山陡崖上或洞口阴处，海拔约为200m，全草在民间供药用，可治疗跌打损伤，烫伤，疮疖等症，2004年被收入《中国植物红皮书》。

密毛小花苣苔分布区域极其狭窄，目前仅在广西柳江地区石灰岩山陡崖上发现少量植株，由于生长环境恶劣缺少水肥，加之其种子细小，萌发需要的温度范围、湿度范围和土壤酸碱度范围比较小，自然界难以进行有性繁殖，急需建立有效的繁育和保护体系，本发明旨在通过组织培养技术叶片两步成苗法对密毛小花苣苔种质资源进行有效的繁育和保护，是目前对密毛小花苣苔育苗最便捷、稳定的手段，可以节约大量的人力、物力和场地，便于种质交换和转移，避免有害病虫的人为传播。

发明内容

本发明目的在于提供一种密毛小花苣苔组培叶片两步成苗方法，能够短时间内提供大量优质适合栽培的密毛小花苣苔种苗。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种密毛小花苣苔组培叶片两步成苗法，其特征在于：

（1）叶片诱导分化不定芽培养：取密毛小花苣苔幼嫩叶片，在75%乙醇中表面消毒30~45s，无菌水2~3次，投入0.1%Hcl₂5min,无菌水2~3次，0.1%Hcl₂3min，无菌水2~3次冲洗干后切分为含主脉0.5cm×1cm大小接种在诱导及分化培养基上，在温度为22~26°C，光照强度1800~2600lux，光照时间为8~10小时/天的条件下，10~15天叶片分化出不定芽；

（2）不定芽壮苗生根培养：选择密毛小花苣苔叶片分化1~1.5个月，幼嫩叶片上分化出具有2片以上叶子、高2~3cm不定芽接种到壮苗生根培养基，在温度为22~26°C，光照强度2000~2800lux，光照时间为8~10小时/天的条件下进行培养，1~2个月不定芽长至高3~6cm的无菌苗,平均生根4条以上、根长2.5~5ｃｍ，生根率达98.4%。

所述诱导及分化培养基为：以ＭＳ为基本培养基，每升添加６-苄氨基嘌呤（６-ＢＡ）1~2.0ｍｇ、3-吲哚乙酸（IＡＡ）0.3~１.0ｍｇ、激动素（KT）0.2~0.5mg、琼脂3.8~4.5ｇ和蔗糖20~25ｇ,ｐＨ值5.8~6.0。

所述壮苗生根培养基为：以１／２ＭＳ为基本培养基，每升添加６-苄氨基嘌呤（６-ＢＡ）0.2~0.5ｍｇ、吲哚丁酸（IBA）1.0~2.0ｍｇ、活性炭（AC）0.5ｍｇ,琼脂3.8~4.5ｇ和蔗糖25~30ｇ,ｐＨ值５.８~6.0。

采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，能够短时间内提供大量优质适合栽培的密毛小花苣苔种苗，并减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，因此简单易行、生产成本降低，有效解决了密毛小花苣苔规模化育苗及种质资源保存问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

一种密毛小花苣苔组培叶片两步成苗法法，包括以下步骤：

（1）叶片诱导分化不定芽培养：取密毛小花苣苔幼嫩叶片，在75%乙醇中表面消毒30~45s,无菌水2~3次，投入0.1%Hcl₂5min,无菌水2~3次，0.1%Hcl₂3min,无菌水2~3次冲洗干后切分为0.5cm×1cm大小接种在诱导及分化培养基上，在温度为22~26°C，光照强度1800~2600lux,光照时间为8~10小时/天的条件下，10~15天叶片分化出不定芽。

最佳的不定芽诱导及分化培养基为：MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.1mg/L+KT0.1mg/L。

（2）不定芽壮苗生根培养：选择密毛小花苣苔叶片分化1~1.5个月，幼嫩叶片上分化出具有2片以上叶子、高2~3cm不定芽接种到壮苗生根培养基，在温度为22~26°C，光照强度2000~2800lux，光照时间为8~10小时/天的条件下进行培养，1~2个月不定芽长至高4~6cm的无菌苗,平均生根4条以上、根长2.5~4.5ｃｍ，生根率达98.4%。

最佳的壮苗生根培养基为1/2MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.5mg/L+AC1.0mg/L。

备注：6-BA（6-苄氨基嘌呤）,KT（激动素）,IAA(吲哚乙酸),IBA(吲哚丁酸),AC(活性炭)。