[发明专利]一种基因组混样测序文库的制备方法

权利要求书

1.一种基因组混样测序文库的制备方法，包括以下步骤：

(1)对需要混样测序样品的基因组DNA进行超声打断，打断的插入片段为350bp；

(2)对超声打断的片段进行纯化，利用NEB末端修复试剂对纯化产物进行末端修复；

(3)对末端修复产物进行纯化，利用特异的含不同标签(Barcode)接头序列分别对纯化 产物进行连接反应，连接试剂采用NEB快速连接试剂；

接头的序列如下：

P5-P7-F(5’-3’)：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN*T

P5-P7-R(5’-3’)：/5Phos/YYYYYAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC

其中，设计的P5-P7-R引物中的五碱基序列YYYYY与P5-P7-F引物中的五碱基序列NNNNN 反向互补，其中NNNNN代表标签(Barcode)序列(表1)，主要用于标记混样各个样本；

(4)对上述连接产物进行纯化，对后续需要混样的纯化产物逐一进行浓度测定；

(5)参照上述纯化产物的浓度和总量，依据所测样本的测序量对纯化产物进行混合，混 合后进行片段筛选，片段筛选采用琼脂糖电泳和切胶回收的方法；

(6)利用含索引(Index)序列的PCR引物对上述的回收片段进行PCR扩增，PCR产物利用 1.6倍体积的磁珠纯化两次，纯化后的产物即为测序文库；

PCR引物序列为：

F(5’-3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC，

R(5’-3’):CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC，

其中，PCR引物R序列中的NNNNNN代表索引(Index)序列，索引用于标记不同的混样文 库，不同混样文库选用不同的索引(Index)引物；

(7)纯化PCR产物进行纯化回收即可得到测序文库；

(8)对上述测序文库进行浓度和片段大小范围检测；将文库浓度将检测合格后的文库 利用Illumina公司的二代测序仪进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的一种基因组混样测序文库的制备方法，其特征在于：所述步骤 (1)中，打断范围为插入片段350bp，可选用超声打断仪CovarisM220，占空因数(Duty factor20％)，峰值功率(Peakincidentpower，50W)，循环破碎系数(Cyclesperburst， 200)，持续时间65秒，工作温度20度(℃)，不同的样品的基因组DNA的起始量相同，起始量为 100～500ng之间，打断体系为50μL。

3.根据权利要求1所述的一种基因组混样测序文库的制备方法，其特征在于：所述步骤 (2)中，采用NEB修复试剂，体系为修复试剂0.75μl，10倍浓度(10×)的修复缓冲液2μL，片段 DNA溶液17.25μL，总体系为20μL，修复条件为20度℃，60分钟(min)；65℃，30min；4℃，终止 (hold)。

4.根据权利要求1所述的一种基因组混样测序文库的制备方法，其特征在于：所述步骤 (3)中，设计了不同标签(Barcode)的特异接头引物(共10种，表1)，采用NEB连接反应试剂， 体系为10×T4DNA连接酶缓冲液2μL，加A连连接液3.75μL，接头(浓度为15μM)1μL，连接增强 液0.25μL，修复DNA溶液18μL，总体系25μL，连接条件为20℃，90min；4度，hold。

5.根据权利要求1所述的一种基因组混样测序文库的制备方法，其特征在于：所述步骤 (5)中，混样根据每个需要测量大小来确定，若所测数据量相同，可进行等量混合；电泳条件 为2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V，1.5小时(h)，切取350-500bp之间的片段进行回 收。