[发明专利]一种转换酵母交配型的方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种转换酵母交配型的方法。本发明所述转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。本发明所述转换酵母交配型的方法可高效、快速转换酿酒酵母单倍体交配型，不依赖酿酒酵母自身染色体结构HMLα和HMRa，无需经过二倍体酿酒酵母阶段，且无需对待转换酿酒酵母菌株进行诱导等处理，直接获得相反交配型酿酒酵母菌株，实验周期短。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种转换酵母交配型的方法，尤其是涉及一种快速转换酿酒酵母交配型的方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母具有单倍体和双倍体两种常见生活方式。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞(酵母的优势形态)也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。它们之间的转换可通过交配(单倍体孢子融合产生双倍体)和孢子形成(双倍体减数分裂产生单倍体孢子)来实现，而这些变化的发生则是由菌株的交配型所决定。酿酒酵母的交配型是由位于酵母染色体Ⅲ上MAT基因座控制的，MAT基因座包括两个等位基因MATa和MATα，因此将酿酒酵母单倍体菌株的交配型(mating-type)分为两种：MATa和MATα。

酿酒酵母MATa和MATα两种交配型的转换主要由HO基因的产物引起的。HO基因在自身启动子作用下表达Ho蛋白，该蛋白会在MAT基因座处产生双链断裂，激活Ⅲ号染色体两端的沉默的HMLα或者HMRa基因座将自身的Yα或者Ya序列复制至MAT基因座处修补双链断裂。在此过程中，酿酒酵母菌株的交配型发生了转换(图1)。

大多数实验室菌株的HO基因己积累了很多突变或者进行了基因失活处理，故不能自发的发生交配型的转换过程，而交配型的相互转化却是酵母研究的重要手段。

交配型转换的传统方法为将载有HO基因的质粒转化到这些细胞中，诱使这些细胞发生交配型的转换。不过利用HO基因诱导酿酒酵母细胞交配型的转换后，异种交配型细胞会立刻相互接触从而产生二倍体细胞，因此还需要进行生孢实验来获得单倍体菌株，实验周期较长。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题提供一种快速转换酿酒酵母交配型的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。

其中，本发明所述转换酵母交配型的方法具体操作为将酿酒酵母感受态细胞与转化体系混合进行酵母转化，然后筛选，分纯；其中所述酿酒酵母感受态细胞为包含pRS415+Cas9质粒的酿酒酵母菌株，所述转化体系包含质粒DNA，所述质粒DNA包括guide-RNA质粒和限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒片段。

优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述感受态细胞的制备方法为挑取携带pRS415+Cas9质粒的酵母菌株单菌落于SC-Leu液体培养基中，30℃过夜培养，然后接种过夜培养液到YPD中30℃、220rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.5，离心，收集细胞；用0.1MLiOAc重悬细胞，离心，吸除部分上清，剩余的LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。

在一些实施方案中，所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4741感受态细胞。