[发明专利]梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及梅毒特异性IgG抗体的检测，尤其是涉及梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法。

背景技术

梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率居高不下，梅毒的防控已成为我国公共卫生服务的主要任务之一。

梅毒的实验室诊断方法主要有如下几种([1]林丽蓉,杨波,潘锡涛,等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010，20(10)：1491-1494)：

(1)病原学检测：梅毒螺旋体感染早期，当梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视野显微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但易受取材技术、取材部位、样本中梅毒螺旋体含量、局部用药及送检时间等诸多因素影响，灵敏度较低。

(2)抗体检测试验：梅毒螺旋体不能进行体外培养，诊断主要依赖于实验室检查，现有的血清学检测灵敏度、特异性不高，任何一种检测方法均存在缺陷，临床漏诊和误诊率较高。

用于梅毒血清学检验的抗原主要以重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47为主([2]Lin,L.R.,Z.G.Fu,etal.Developmentofacolloidalgold-immunochromatographyassaytodetectimmunoglobulinGantibodiestoTreponemapallidumwithTPN17andTPN47.Diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease.2010.68(3):193-200.)，检测方法包括生物素亲和素检测法(中国专利CN201410410641.4)、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验等方法，这些检测方法的结果判断需要特殊的仪器设备，前者需要酶标仪，而后者不仅需要荧光显微镜，还需要有经验丰富的技术人员进行结果判读，因此在基层或边远地区，急需一种灵敏度和特异性较高的梅毒螺旋体特异性抗体检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供不需要特殊仪器，也可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强的梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法。

本发明包括如下步骤：

1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47。

2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位；取抗原混合物加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭；将封闭后之硝酸纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，晾干后得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴燥处备用；

3)以人γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人γ链单克隆抗体。

4)采用过碘酸钠法进行抗人γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；

5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下,光滑面向上置于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育；

6)在硝酸纤维素膜中加入磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

7)加入50μL步骤4)中的辣根过氧化物标记的抗人γ链单克隆抗体,37℃孵育10min；

8)用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

9)显色：加入3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色剂50μL，37℃放置5min，所述DAB显色剂按50mgDAB加入0.05mol/LTris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制；

10)加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；

11)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。

在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔可采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔；所述抗原混合物的用量可为0.5μL；所述奶粉可采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉；所述封闭的时间可为30min；所述磷酸盐缓冲液可采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。

在步骤5)中，所述孵育的时间可为10min。

在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL，摩尔浓度为0.01mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；所述洗涤可洗涤3次,每次2min。