[发明专利]棘胸蛙快速无损伤取样方法

说明书

本发明公开了一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，本发明通过棘胸蛙空腔表皮细胞及分泌粘液的特点，运用自制的灭菌塑料膜棉签，对棘胸蛙口腔内细胞进行取样，将取出的口腔细胞放入离心管，加入PBS，使口腔细胞充分融入PBS中，然后用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA。本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法具有对棘胸蛙机体损伤小、取样速度快、死亡率低、提取DNA效果好、方法简便、易于操作等特点。

技术领域

本发明属于蛙类分子生物学研究领域，具体的说是涉及一种棘胸蛙快速无损伤取样方法。

背景技术

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)又名石蛙、石鸡、石鳞，是我国特有的大型野生蛙，是蛙科系统关系研究的重要类群，对于研究两栖动物的进化和地理分布等都有着重大的科研价值。棘胸蛙含有高蛋白质、氨基酸、多种维生素和矿物质，肉质脆嫩，味道鲜美，具有清热解毒、滋补强身、防癌抗癌，而且还具有健肝润肺、清心明目、乌发驻颜、治疗疳疾等药用功效。

近年来，随着棘胸蛙食用及药用价值被人们所认识，棘胸蛙越来越受到消费者的喜爱，市场需求不断攀升。同时，对棘胸蛙的研究也越来越深入，逐渐从外部形态向蛋白质、基因等方面转变，尤其对其系统发生关系研究成了近年来研究的热点题。由于人们滥杀和大量使用农药，污染水质，致使生态环境不断恶化，造成野生棘胸蛙日趋减少。实验室对棘胸蛙的研究，必不可少的要提取棘胸蛙的肌肉，而传统的棘胸蛙的取样方法大多都是将棘胸蛙杀掉，取其腿部肌肉，进行DNA提取，近来，也有学者运用剪取棘胸蛙脚趾的方法进行改良实验，但根据本实验室的实验效果，这种剪脚趾的方法并不能保证棘胸蛙能存活下来，做了实验证明这种剪脚趾的方法，养殖15天后70％的棘胸蛙样本会死亡。

目前现有的从动物(包括人)口腔中利用粘液、粘膜提取DNA的方法例如有申请号为201210554081.0的发明《适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法》，其方案如下：

适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于：(1)、样本的预处理过程为：刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀；(2)、DNA样本的提取过程为：在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul的20mg/ml蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60-80℃，期间每隔10min震荡一次；(3)、DNA样本的纯化处理及检测过程为：取出Ep管瞬甩，加入180-200ul的溶解液2，60-80℃保温10-15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入1-3ml的70％乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5-8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。

但是，采用上述方法提取棘胸蛙DNA效果不佳。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，以实现环保、快速、无损伤的提取棘胸蛙DNA。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，包括如下步骤：

1)、利用灭菌后的塑料膜棉签黏取蛙的口腔粘液；

2)、将黏取了蛙口腔粘液的棉签放入至装有190～210ul(较佳为200ul)磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管(1.5ml离心管)中，搅拌均匀；从而使口腔粘液中的细胞尽量多融入磷酸缓冲盐溶液(PBS)中；