[发明专利]一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于，免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记单抗的聚酯膜，所述的单抗由保藏号为CGMCC No.12006的15G6杂交瘤细胞株分泌；硝酸纤维素膜的检测线即T线上结合有保藏号为CGMCC No.5535的3F1细胞株分泌的单抗，质控线即C线上结合有羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所述的快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于能准确、特异、灵敏地检测水稻、玉米和白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，且其检测水稻病叶的灵敏度达到1:5120倍稀释，单位为克/mL，检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1:51.2倍稀释，单位为头/mL。

3.如权利要求1所述的快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于该试纸条检测感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻、玉米和白背飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染甘蔗花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒的玉米和健康玉米均呈阴性结果。

4.一种如权利要求1所述的快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)南方水稻黑条矮缩病毒单抗的制备：用感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、细胞克隆杂交瘤技术获得1株能稳定传代并分泌抗SRBSDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株15G6，其保藏号为CGMCC No.12006，该杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔，制备单抗腹水；

2)胶体金溶液制备：将100mL 0.01％氯金酸加热沸腾，加入1mL 1％柠 檬酸三钠后混匀，再保持沸腾25min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

3)南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金溶液制备：取100mL胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃将其pH值调至8.0，边搅拌边加入3mL 2mg/mL的抗南方水稻黑条矮缩病毒15G6单抗，搅拌20min；再逐滴加入2mL 25M分子量为20,000的聚乙二醇溶液，搅拌15min；4℃20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4含0.4M PEG 20,000的PBS缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清，沉淀悬浮、离心重复1次，用5mL pH 7.4含2％BSA的PBS缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为免疫胶体金溶液4℃保存备用；

4)将上述南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释11倍，用喷金机按3.0μL/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金垫；

5)将1.5mg/mL抗南方水稻黑条矮缩病毒3F1单抗用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释10倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即T线上；1mg/mL的羊抗鼠IgG用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即C线上，使T线和C线相距5mm；

6)将吸水滤纸制成的样品垫、南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金垫、点有T线和C线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到PVC胶板上，切割成60mm×3mm的条子后组装成试纸条。