[发明专利]3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-S-转硫酶的显色底物

说明书

技术领域

本发明属于酶生物技术领域，涉及通过跟踪吸收变化测定谷胱甘肽-S-转硫酶即GST活性的显色底物；此类底物在GST作用下与谷胱甘肽GSH反应生成对应苯环上4-位氯原子被GSH中硫原子取代的苯硫醚，便于通过测定产物吸收确定酶活性和筛选GST抑制剂。

背景技术

谷胱甘肽硫转硫酶(GST)是广泛分布于各种生物体内的一组多功能同工酶，其主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联生成加合物，降低其化学反应活性，并促进偶联的加合物被排出细胞，避免对细胞的毒性。GST的这些活性使得其抑制剂成为抑制肿瘤生长的药物，用酶标板高通量筛选GST抑制剂就成为重要的技术。常用的酶标仪能通过跟踪吸收高通量测定GST活性，这就需要显色底物用于高通量筛选GST的抑制剂。目前测定GST活性常用还原性谷胱甘肽即GSH与1-氯-2，4-二硝基苯即CDNB反应，生成苯环上氯原子被取代的苯硫醚产物；此产物相对于两种底物的吸收在340nm显著增强，便于测定GST活性和表征GST的抑制剂。但CDNB在水中溶解性太差而依赖于有机溶剂作为溶剂。常用作为药物筛选靶的GST同工酶对有机溶剂很敏感。因此，需要水溶性更强的GST显色底物测定GST活性，以便于高通量筛选GST抑制剂。

设计GST显色底物的最简易思路是设计苯环上带有易于在GST催化下被GSH取代的离去基团的苯环衍生物。作为GST的显色底物，其苯环上的离去基团需要有邻对位的基团促进其离去以提高GST活性；其离去基团应吸电子但共而效应弱，使得被GSH取代后共轭体系增大而在长波长处出现新的吸收峰或吸收显著增强。CDNB就在邻对位分别用了两个硝基吸电子促进氯原子的离去和增加产物的共轭体系，使产物吸收峰红移且酶催化活性较高；在远离这类离去基团的位置引入不共轭但能增溶的基团，就能得到水溶性更好的显色底物。

为便于合成，本发明设计在氯苯对位有便于引入增溶基团的苯磺酰胺衍生物，并在氯原子邻位用硝基促进氯原子离去、增加酶活性和增大产物的共轭体系。

发明内容

1.3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-S-转硫酶的显色底物，其结构特征如下：

2.据权利要求1所述3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-S-转硫酶的显色底物，其应用特征是在谷胱甘肽-S-转硫酶即GST催化作用下，该显色底物与还原性谷胱甘肽即GSH反应生成4-位氯原子被GSH巯基取代的苯硫醚；相对于所述显色底物，此苯硫醚产物在285nm前后10nm范围内的吸收有显著增加；选择在285nm前后10nm波长范围内的某个波长作为测定波长，测定此波长下吸收变化的初速度表示GST的活性，或者据产物的差消光系数进一步换算成产物生成初速度表示GST活性。

3.据权利要求1所述3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-S-转硫酶的显色底物，其合成过程特征为用所需甘氨酸、乙醇胺、氨基乙磺酸、N，N-二甲基乙二胺之一，与3-硝基-4-氯苯磺酰氯在不高于30摄氏度下反应；反应溶剂、反应物投料比及操作特征如下：

(1)甘氨酸和氨基乙磺酸用四氢呋喃或1，4-二氧六环与水的混合溶剂溶解，添加碳酸钠/钾或碳酸氢钠/钾中和所生成的酸，且氨基化合物摩尔量比3-硝基-4-氯苯磺酰氯过量5倍以上；

(2)乙醇胺和N，N-二甲基乙二胺直接作为溶剂，或用二氯甲烷、氯仿将氨基化合物稀释后与3-硝基-4-氯苯磺酰氯反应，且氨基化合物摩尔量比3-硝基-4-氯苯磺酰氯过量2倍以上；

(3)将氨基化合物的混合物或溶液转移到密闭的容器中；3-硝基-4-氯苯磺酰氯用四氢呋喃、1，4-二氧六环或其他与氨基化合物溶液相容的溶剂溶解，用恒压漏斗滴加到含氨基化合物的密闭容器中，搅拌反应2小时以上，得到产物混合物；

(4)用乙醇胺或N，N-二甲基乙二胺所得产物混合物，滤去沉淀，过硅胶柱层析纯化；

(5)用甘氨酸所得产物混合物滤去沉淀，减压去有机溶剂进行浓缩，加浓盐酸到pH＜2.0收集固体；水相再用二氯甲烷或氯仿萃取，萃取液浓缩后与酸化后收集的固体合并，用二氯甲烷或氯仿溶解，过硅胶柱纯化；

(6)用氨基乙磺酸所得产物混合物浓缩后滤去沉淀，再加浓盐酸到pH＜2.0收集固体为目标产物；用异丙醇、丙酮或乙腈和水的混合溶剂重结晶收集所得固体为目标产物。

应用实施例1：3-硝基-4-氯本磺酰乙醇胺的合成

(1)取4-氯-3-硝基苯甲酰氯1.0g溶解在5mL二氯甲烷中作为混合液A；