[发明专利]一种制备稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶MoMps1晶体的方法

说明书

本发明涉及蛋白质晶体的制备，具体说来，公开了一种制备稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶MoMps1蛋白质晶体的方法：1)将稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶MoMps1溶于HEPES或PBS Buffer中，获得终浓度为8～10mg/mL的MoMps1蛋白质，将所述的MoMps1蛋白质与晶体生长试剂按10％～80％的体积比混合，得到0.3～0.8μL的液滴；2)置于4～22℃的恒温箱中培养10～20天，即可得到所述晶体。其中，所述晶体生长试剂的组分包括：10％～60％V/V Tacsimate；0.001～0.5M二甲砷酸钠；0.01～10.0mM精胺；pH值为3.0～9.5。本发明开展了稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶MoMps1蛋白质晶体生长方法的探索，通过一系列的筛选，获得了晶体质量高、衍射数据好、重复性好的蛋白质晶体生长方法。

技术领域

本发明涉及蛋白质晶体的制备，具体说来，涉及一种稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶MoMps1晶体的制备方法。

背景技术

蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命的存在，而蛋白质的三维结构往往决定了其功能，所以确定蛋白质的三维结构对了解与阐释生命现象与生命活动有着重要的意义。目前，利用X射线技术来确定和解析蛋白质的三维结构是公认的最为可靠的方法，尤其是近年来，利用结构生物学手段来研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与转录因子相互作用，进而回答相关蛋白质的互作机制已发挥着非常重要的作用。但是蛋白质晶体的生长，尤其是高分辨率、重复性好的晶体生长方法一直是此领域研究的“瓶颈”，这对利用结构生物学的手段来阐释上述机制具有很大的限制。具体说来，主要表现在，蛋白质不稳定、易降解或沉淀；蛋白质样品不结晶；蛋白质样品能够结晶但是衍射数据差，分辨率低等方面。

水稻是世界的主要粮食作物之一，世界上约有50％的人口以稻米作为主食。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染水稻引起的稻瘟病是世界各水稻产区普遍发生、危害极大的真菌性病害，也是制约水稻安全生产和粮食安全供给的重要威胁之一。据报道，每年由稻瘟病菌引起的水稻产量损失约在10％～30％，对世界粮食安全产生了巨大的影响(Kato,2001)。正是由于稻瘟病菌在科学研究和经济上的重要性，稻瘟病菌被列为十大病原真菌之首(Dean et al.,2012)，是开展相关科学研究的重要模式真菌。

已有的研究(Hamel et al.,2012)表明，在稻瘟病菌中主要存在3条由MAPKKK，MAPKK和MAPK组成的信号通路，其自上而下形成级联反应，通过与下游的转录因子相互作用而调控致病力，影响稻瘟病菌的致病性。MoMps1是一种对稻瘟病菌的生长发育起重要调控作用的促分裂原活化蛋白激酶。在稻瘟病菌中，MoMps1参与的功能主要包括调节细胞壁的完整性、应对不良环境条件的反应以及调控致病性等方面，其中，MoMps1对细胞壁的完整性、孢子的侵入生长是必需的(Xu et al.,1998)；Moswi6是位于MoMps1下游的转录因子之一，受MoMps1的调控与制约，缺失MoSwi6能够影响稻瘟病菌细胞壁的完整性，胞外酶的活性和以及转录水平显著减少，同时对来自外界的氧化压力的抵抗能力显著降低。基于已有的研究报道(Qi et al.,2012)，无论是体内还是体外，MoMps1与MoSwi6均存在相互作用，且MoMps1主要是通过与其下游的转录因子如Moswi6等的相互作用而调控致病性，但是其与下游的转录因子的互作机制目前尚不清楚，需要进一步研究。因此，亟需针对稻瘟菌促分裂原活化蛋白激酶MoMps1提供一种蛋白质晶体的生长方法，用以制备MoMps1蛋白质的晶体，为上述研究提供基础。