[发明专利]酿酒酵母染色体的转移方法

权利要求书

1.酿酒酵母染色体的转移方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将待转移染色体对应于相反交配型细胞中的染色体进行改造，在着丝粒前添加GAL1启动子；

步骤2：将待转移染色体的酵母菌株与改造后的酵母菌株进行融合，构建二倍体酿酒酵母菌株；

步骤3：利用半乳糖诱导丢失添加GAL1启动子的染色体，并利用SC+5-FOA培养基进行筛选；

步骤4：通过生孢和孢子拆分，获得染色体转移后的酿酒酵母单倍体菌株。

2.根据权利要求1所述的转移方法，其特征在于，所述染色体为V号染色体和X号染色体。

3.根据权利要求2所述的转移方法，其特征在于，步骤2之前还包括在着丝粒前添加营养筛选标记。

4.根据权利要求3所述的转移方法，其特征在于，所述营养筛选标记为乳酸克鲁维酵母尿嘧啶基因营养筛选标记。

5.根据权利要求1至4任一项所述的转移方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：向待转移V号染色体的菌株中的X号染色体着丝粒前添加GAL1启动子和乳酸克鲁维酵母尿嘧啶基因营养筛选标记；

步骤2：利用步骤1的方法向待转移X号染色体的菌株中的V号染色体着丝粒前添加GAL1启动子和乳酸克鲁维酵母尿嘧啶基因营养筛选标记；

步骤3：步骤1和步骤2中的菌株的交配型分别为MATα和MATa，两个菌株交配型相反，将所述两个菌株进行细胞融合，挑选二倍体菌株；

步骤4：利用半乳糖诱导二倍体菌株中GAL1启动子表达，将菌株涂布于SC+5-FOA培养平板上筛选，挑取SC+5-FOA培养平板上生长的单菌落在SC+5-FOA培养平板上划线分纯，得到丢失天然酿酒酵母5号染色体和天然酿酒酵母10号染色体两条染色体的酿酒酵母二倍体菌株；

步骤5：对步骤4中的二倍体酿酒酵母菌株进行生孢、孢子拆分，获得携带目标染色体合成型酿酒酵母5号染色体和合成型酿酒酵母10号染色体的酿酒酵母单倍体菌株；

步骤6：挑取孢子拆分后的单菌落于5mL YPD液体培养基中30℃过夜培养，提取基因组并使用GoTaq Green Master Mix利用PCR反应进行验证；利用特异性区分合成型酿酒酵母5号染色体和天然酿酒酵母5号染色体以及合成型酿酒酵母10号染色体和天然酿酒酵母10号染色体的引物进行PCR反应，结果显示同时存在两个目标染色体合成型酿酒酵母5号染色体和合成型酿酒酵母10号染色体，而不存在天然酿酒酵母5号染色体和天然酿酒酵母10号染色体染色体，证明成功转移了染色体。

6.一种酿酒酵母单倍体菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将待转移染色体对应于相反交配型细胞中的染色体进行改造，在着丝粒前添加GAL1启动子；

步骤2：将待转移染色体的酵母菌株与改造后的酵母菌株进行融合，构建二倍体酿酒酵母菌株；

步骤3：利用半乳糖诱导丢失添加GAL1启动子的染色体，并利用SC+5-FOA培养基进行筛选；

步骤4：通过生孢和孢子拆分，获得染色体转移后的酿酒酵母单倍体菌株。

7.根据权利要求6所述的酿酒酵母单倍体菌株的构建方法，其特征在于，所述染色体为V号染色体和X号染色体。

8.根据权利要求7所述的酿酒酵母单倍体菌株的构建方法，其特征在于，步骤2之前还包括在着丝粒前添加营养筛选标记。

9.根据权利要求6至8任一项所述的酿酒酵母单倍体菌株的构建方法，其特征在于，所述营养筛选标记为乳酸克鲁维酵母尿嘧啶基因。

10.根据权利要求9所述的酿酒酵母单倍体菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：向待转移V号染色体的菌株中的X号染色体着丝粒前添加GAL1启动子和乳酸克鲁维酵母尿嘧啶基因营养筛选标记；

步骤2：利用步骤1的方法向待转移X号染色体的菌株中的V号染色体着丝粒前添加GAL1启动子和乳酸克鲁维酵母尿嘧啶基因营养筛选标记；

步骤3：步骤1和步骤2中的菌株的交配型分别为MATα和MATa，两个菌株交配型相反，将所述两个菌株进行细胞融合，挑选二倍体菌株；

步骤4：利用半乳糖诱导二倍体菌株中GAL1启动子表达，将菌株涂布于SC+5-FOA培养平板上筛选，挑取SC+5-FOA培养平板上生长的单菌落在SC+5-FOA培养平板上划线分纯，得到丢失天然酿酒酵母5号染色体和天然酿酒酵母10号染色体两条染色体的酿酒酵母二倍体菌株；

步骤5：对步骤4中的二倍体酿酒酵母菌株进行生孢、孢子拆分，获得携带目标染色体合成型酿酒酵母5号染色体和合成型酿酒酵母10号染色体的酿酒酵母单倍体菌株；

步骤6：挑取孢子拆分后的单菌落于5mL YPD液体培养基中30℃过夜培养，提取基因组并使用GoTaq Green Master Mix利用PCR反应进行验证；利用特异性区分合成型酿酒酵母5号染色体和天然酿酒酵母5号染色体以及合成型酿酒酵母10号染色体和天然酿酒酵母10号染色体的引物进行PCR反应，结果显示同时存在两个目标染色体合成型酿酒酵母5号染色体和合成型酿酒酵母10号染色体，而不存在天然酿酒酵母5号染色体和天然酿酒酵母10号染色体染色体，证明成功转移了染色体。