[发明专利]猴STLV1病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的检测方法及抗原技术领域，具体涉及一种猴 STLV1病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。

背景技术

猴T淋巴细胞趋向性病毒1型(SimianTlymphotropicvirustypel， STLV1)是猴群中一种重要的传染性病毒，该病毒主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的 病变或免疫机能紊乱，从而影响动物实验的研究。早在1992年，中华人民共和国卫生部颁布 的《医学实验动物标准》就规定了，STLV1型是SPF实验猴必须排除的病毒之一。李绍东等 对我国恒河猴的STLV1流行病学特征进行调查发现，我国野生和饲养恒河猴血清中广泛 存在STLV1抗体。

饶军华等对华南地区一个大型灵长类繁育中心恒河猴、食蟹猴猴群近3年的STLV1 感染状况的检测结果也证实这一观点，并且发现猴群STLV1的平均感染率为4.97%，食 蟹猴比恒河猴更容易感染STLV1。随着当前国际市场对SPF实验猴需求量的增加，STLV1 病毒已被列为必须排除的病原之一。目前国内外有几种检测STLV1的方法，如国家标准规 定的免疫荧光(IFA)检测方法，但该方法操作复杂，而且对设备的要求苛刻，不适合大样本 的检测；国外已研制出STLV1型商品化ELISA抗体检测试剂盒(美国BioReliance公 司)，虽然准确率较高，但价格非常昂贵且仅限于实验室使用。实际上，STLV1检测技术已经 在某种程度上成为制约我国实验猴SPF种群建立的技术瓶颈之一。因此建立一种快速、准 确检测STLV1抗体的方法，并研制出操作简单、准确率高、价格低廉的试剂盒，对推动国内 实验猴SPF种群的建立，进一步提升我国实验猴的国际竞争力具有重大意义。

免疫梳方法是能够对病毒血清抗体进行定性、定量检测的一项新型体外诊断技 术，这种技术突破性地将病毒抗原点布在具有极强蛋白吸附力的硝酸纤维膜上，把包被好 的抗原膜贴附于PVC板以增加膜的强度和硬度，经机器裁切制成免疫梳。将此免疫梳插入稀 释好的待检血清样本时，特异性抗体与抗原结合并固着于膜上，再通过酶标二抗底物反应， 染色后，抗体阳性的样本表现为肉眼可见的红色斑点，阴性则无颜色变化。膜经过图像处理 系统数据化后可以进行定量分析。

发明内容

本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种猴STLV1 病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

1、一种用于构建猴STLV1病毒抗体的免疫梳的SOE-PCR引物组，引物STLV1F：如序列表 SeqNo.1所示，引物STLV1R：如序列表SeqNo.2所示。

2、一种用于制备猴STLV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-STLV1，序 列如序列表SeqNo.3所示。

3、一种用于制备猴STLV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-STLV1的构 建方法，包括如下步骤：

（1）根据猴STLV1病毒的基因序列，设计SOE-PCR扩增引物，引物STLV1F：如序列表Seq No.1所示，引物STLV1R：如序列表SeqNo.2所示；

（2）进行SOE-PCR扩增猴STLV1病毒基因；

（3）猴STLV1病毒基因的回收；

（4）克隆质粒pMD18T-STLV1的构建及测序；

（5）表达载体pGEX-4T-STLV1的构建，序列如序列表SeqNo.3所示。

4、如上所述的一种用于制备猴STLV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T- STLV1的构建方法，所述的步骤（2）采用SOE-PCR反应的具体步骤如下：

将混合液在95℃预变性5min，94℃变性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30 个循环，72℃总延伸10min；

上述混合液如下所示：