[发明专利]PML/RARα融合基因检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种PML‑RARα融合基因检测试剂盒以及检测方法，该试剂盒包括有针对PML基因L型断裂热点上游基因序列的第一组探针和针对RARα全基因序列的第二组探针；每条探针标记有染料，该两组探针标记的染料的颜色彼此不同；所述两组探针为分别以人外基因组DNA为模板，通过扩增引物得到的扩增产物。本发明所述的探针具有很强的特异性，背景噪音更低，其能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7‑8个小时内完成，提高了检测效率。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种PML/RARα融合基因检测试剂盒和检测方法。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓细胞白血病的一种特殊类型，被FAB协作组定为急性髓细胞白血病M3型，其特点是骨髓及其他造血组织中有大量白血病细胞无限制地增生，并进入外周血液，而正常血细胞的制造被明显抑制，该病居年轻人恶性疾病中的首位，病因至今仍不完全清楚。95％的APL患者具有t(15；17)染色体异常，形成的PML-RARα融合基因是其分子标志。

位于15q22的PML基因与位于17q21的RARα基因相互易位，形成PML-RARα融合基因。由于PML基因的断裂点不同，而RARα断裂点恒定(2号内含子)，导致可以产生相应的3种不同PML-RARα融合基因的异构体：位于第6内含子的断裂点，形成长型(L型)融合基因，约占病人的55％；位于第3内含子的断裂点，形成短型(S型)融合基因，约占病人的40％；位于第6外显子的断裂点，形成变异型(V型)融合基因，约占病人的5％；其中以长型和短型融合基因为主。PML-RARα融合基因表达的融合蛋白干扰了正常RARα在核内的分布和对细胞分化的调控，使大量细胞阻滞在早幼细胞阶段，在APL发病机制中起重要作用。有研究报道，在复发前的3～6个月PML/RARα融合基因的转录信号显著增强；缓解1年，查PML/RARα融合基因仍可阳性。由此可见，PML/RARα融合基因的预报复发，即使经治者只含少量残留细胞同样可检测到。不同的基因异构体分型的预后有明显不同，S型患者缓解前的死亡率及缓解后的复发率均高于L型。因此，对PML/RARα融合基因进行检测和分型，能更好地指导患者分子靶向治疗及预后判断。

目前，PML-RARα融合基因的检测方法主要包括以下3种：细胞遗传学检测、基于PCR方法的检测和FISH检测。细胞遗传学检测需培养细胞，耗时较长，只能检测中期的细胞，且成功率和灵敏度低；基于PCR的检测如RT-PCR、Q-PCR等易污染，假阳性率高，只能检测已知的断裂点，对未知或含少量转录本的PML-RARα融合基因无法检出。FISH检测对病人外周血或骨髓的PML-RARα融合基因具有极高的灵敏度和检测隐匿型易位的能力，其假阳性率远远低于PCR检测，能提供相对于核型分析更为可靠的分子遗传学证据，可用于预后判断、用药疗效、微小病灶残留及移植术后效果的监测。虽然。目前FISH检测方法得到了广泛的应用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)以BAC为模板制备的探针中存在较多的重复序列，影响杂交的特异性，同时造成较高的背景荧光；(2)检测步骤繁杂，探针序列过长，探针与样本杂交往往需要12-16h才能保证充分杂交，费时费力；(3)一些优化的探针序列过短，导致检测特异性降低且信号微弱难以被检测；(4)由于断裂点之间距离较近，现有的FISH产品不能对PML-RARα融合基因进行分型。因此，急需一种FISH检测方法，其探针不含重复序列、长度适宜，既能保证杂交反应的特异性和最佳的荧光检测强度，又能最大限度缩短FISH检测时长，提高检测特异性和检测效率，同时可区分PML-RARα融合基因类型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高和检测效率高的PML-RARα融合基因检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。