[发明专利]BCR/ABL基因融合与ASS基因缺失检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种BCR/ABL基因融合与ASS基因缺失检测试剂盒，该试剂盒包括有染料标记的，针对ASS和ABL基因序列的第一组探针，针对BCR基因M‑BCR断裂位点上游基因序列的第二组探针，两组探针标记的染料的颜色都不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过引物扩增得到的扩增产物。本发明FISH探针的长度是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优长度，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7‑8个小时内完成，提高了检测效率。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种BCR/ABL基因融合与ASS基因缺失检测试剂盒。

背景技术

慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到费城染色体(Ph)或(和)BCR/ABL基因重排。由于t(9；22)(q34；q11.2)而产生的费城染色体或(和)BCR/ABL基因重排在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义，出现于90％以上的CML、30％的成人急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)、2％-10％的儿童ALL、以及少数的急性粒细胞白血病(Acute Myelogenous Leukemia，AML)和多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者。

位于22q11的BCR基因与位于9q34的ABL基因相互易位，形成BCR/ABL融合基因。BCR基因共23个外显子，主要有两种断裂热点：在CML中几乎都为M-BCR位点(跨越外显子12-16的58kb区域)，而在ALL中大约2/3为m-BCR位点(第一内含子的55kb区域)。ABL基因有1b、1a和2～11共12个外显子，上游与ASS基因相连，其断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，BCR/ABL融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样，不同的融合产物与疾病的类型和疾病的进展相关，且具有不同的致癌能力。BCR/ABL融合基因是一种抗细胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，激活多种信号传导途径，抑制细胞凋亡，使细胞过度增殖而使细胞调控发生紊乱。具有BCR/ABL融合基因的患者预后差，临床上可以根据患者是否存在BCR/ABL融合基因来选择性地使用分子靶向治疗药物。大约10-30％的患者在衍生的9号染色体上ABL/BCR融合基因出现部分或完全缺失，缺失区域位于ABL与BCR基因融合之处，可长达几MB，典型体现为包括ASS基因所在的区域。临床发现此区域出现缺失的患者意味着更短的无病生存期和总生存期，治疗效果及预后更差。因此，对BCR/ABL融合基因检测，能更好地指导患者分子靶向治疗及预后判断。

目前，常规的BCR/ABL融合基因检测方法主要包括以下3种：细胞遗传学检测、基于PCR方法的检测和FISH检测。细胞遗传学检测需培养细胞，耗时较长，只能检测中期的细胞，且成功率和灵敏度低，无法对Ph阴性但存在BCR/ABL融合基因的患者做出诊断和预后；基于PCR的检测如RT-PCR、Q-PCR等易污染，假阳性率高，且只能检测已知的断裂点，对未知或含少量转录本的BCR/ABL融合基因无法检出。FISH检测对病人外周血或骨髓的BCR/ABL融合基因具有极高的灵敏度和检测隐匿型易位的能力，其假阳性率远远低于PCR检测，能提供相对于核型分析更为可靠的分子遗传学证据，可用于预后判断、用药疗效、微小病灶残留及移植术后效果的监测。虽然目前FISH检测方法得到了广泛的应用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)使用人工染色体制备的检测探针中存在较多的重复序列，影响杂交的特异性，同时造成较高的背景荧光；(2)检测步骤繁杂，探针序列过长，探针与样本杂交往往需要12-16h才能保证充分杂交，费时费力；(3)一些优化的探针序列过短，导致检测特异性降低且信号微弱难以被检测。因此，急需一种FISH检测方法，其探针不含重复序列、长度适宜，既能保证杂交反应的特异性和最佳的荧光检测强度，又能最大限度缩短FISH检测时长，提高检测特异性和检测效率。

发明内容