[发明专利]AML1/ETO融合基因检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了AML1/ETO融合基因检测试剂盒，其特征在于，包括有针对AML1基因断裂的第一组探针和针对ETO基因断裂的第二组探针，两组探针标记有染料，同一组探针的染料颜色相同，不同组探针的染料颜色不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过扩增引物得到的扩增产物。本发明所述探针是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优长度，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7‑8个小时内完成，提高了检测效率。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种AML1/ETO融合基因检测试剂盒和检测方法。

背景技术

急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)，主要表现为粒系原始细胞的恶性增殖，它有两个亚型：粒细胞白血病未分化型(M1)与粒细胞白血病部分分化型(M2)。文献报道l2％-20％的急性粒细胞白血病(AML)存在t(8；21)(q22；q22)染色体易位，尤其在AML-M₂，其发生率可高达40％-80％。

位于染色体21q22的AML1基因与8q22的ETO基因融合，产生AML1/ETO和ETO/AML1融合基因，一般认为ETO/AML1融合基因表达量极低或者由于降解导致表达不稳定，故现阶段的研究多集中AML1-ETO融合基因。AML1基因又称RUNX1基因，含12个外显子，全长超过260kb，其断裂点80-90％位于内含子1，其余则发生在内含子2。AML1/ETO融合蛋白是一种转录抑制因子，可抑制正常AML1蛋白介导的功能，改变造血祖细胞自我更新及成熟过程，同时也产生启动异常造血细胞增殖的信号，引起白血病细胞生长。临床上t(8；21)(q22；q22)白血病好发于青年和儿童(5％～10％)，主要与M2型密切相关，并且年龄越小发生率越高。AML1/ETO融合基因阳性是患者预后好的标志，其完全缓解(CR)率可达90％，5年长期无病生存率(event-free survival，EFS)可达50％-70％，经化疗或BMT后大部分病人可在短期内转为阴性，但仍有转阳性的可能，及时治疗可再次转阴性，由阴性转阳性或持续阳性可能预示复发。因此，AML1/ETO融合基因的检测对患者M2诊断分型、预后评估及复发监测具有重要的意义。

目前AML1/ETO融合基因的检测方法主要包括以下3种：细胞遗传学检测、基于PCR方法的检测和FISH检测。细胞遗传学检测需培养细胞，耗时较长，只能检测中期的细胞，且成功率和灵敏度低；基于PCR的检测如RT-PCR、Q-PCR等易污染，假阳性率高，只能检测已知的断裂点，对未知或含少量转录本的AML1/ETO融合基因无法检出。FISH检测对病人外周血或骨髓的AML1/ETO融合基因具有极高的灵敏度和检测隐匿型易位的能力，其假阳性率远远低于PCR检测，能提供相对于核型分析更为可靠的分子遗传学证据，可用于预后判断、用药疗效、微小病灶残留及移植术后效果的监测。虽然。目前FISH检测方法得到了广泛的应用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)以BAC为模板制备的探针中存在较多的重复序列，影响杂交的特异性，同时造成较高的背景荧光；(2)检测步骤繁杂，探针序列过长，探针与样本杂交往往需要12-16h才能保证充分杂交，费时费力；(3)一些优化的探针序列过短，导致检测特异性降低且信号微弱难以被检测。因此，急需一种FISH检测方法，其探针不含重复序列、长度适宜，既能保证杂交反应的特异性和最佳的荧光检测强度，又能最大限度缩短FISH检测时长，提高检测特异性和检测效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高和检测效率高的AML1/ETO融合基因检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种AML1/ETO融合基因检测试剂盒，包括有针对AML1基因断裂的第一组探针和针对ETO基因断裂的第二组探针，两组探针标记有染料，同一组探针的染料颜色相同，不同组探针的染料颜色不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过扩增引物得到的扩增产物；