[发明专利]乌塌菜总RNA的高效提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物RNA的提取工艺，具体地说，涉及乌塌菜总RNA 的高效提取方法。

背景技术

乌塌菜又名塌菜、黑菜等，为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变 种，以墨绿色叶片供食，主要分布于我国长江流域。目前，针对乌塌 菜的分子生物学研究，尚未建立适宜的RNA提取方法。

乌塌菜细胞在细胞壁破碎后，所含多糖、蛋白质等次生代谢物以 不同方式干扰RNA的提取，细胞内以及操作体系中存在的RNA酶将 会对分离组织中的RNA进行降解，从而影响后续研究。本发明在充分 借鉴十字花科其他作物RNA提取方法的基础之上，建立了乌塌菜总 RNA高效提取方法。

发明内容

本发明旨在提供一种获得高纯度高浓度无降解的乌塌菜总RNA 的高效提取方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的乌塌菜总RNA的高效提取方 法，包括以下步骤：

1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)加入液氮快速研磨成粉末，倒入 离心管中；

2)向上述粉末中加入Trizol裂解液，将离心管置于旋窝机中震荡 后室温静置，然后4℃离心；

3)将上清液置于另一离心管中，向上清液中加氯仿，震荡后室 温静置，然后4℃离心；

4)将上清液转移至另一离心管中，加异丙醇上下颠倒摇匀，-20 ℃静置后，4℃离心；

5)弃去上清液，用不同浓度的乙醇洗RNA沉淀，4℃离心，弃去 上清液，RNA置于超净工作台室温干燥后(注意不要过分干燥)，用 不含RNA酶的灭菌水溶解，-80℃保存。

前述的方法，步骤1)具体为：取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)0.1mg， 剪碎后，分2-3次加入15-20mL液氮，在3-5min内迅速将叶片充分研 磨成粉末，操作在超净工作台上完成(避风环境)。

前述的方法，步骤2)具体为：向步骤1)的粉末中加入1-1.5mL Trizol裂解液，将离心管置于旋窝机中剧烈震荡后室温静置3-5min， 然后4℃，12000rpm离心3-5min。

前述的方法，步骤3)具体为：将步骤2)所得上清液置于另一离 心管中，向上清液中加0.15-0.3mL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡 15-30s后，室温静置3-5min，然后4℃，13000rpm离心5-15min。

前述的方法，步骤4)具体为：将步骤3)所得上清液转移至另一 离心管中，加等体积的4℃异丙醇，上下颠倒摇匀，-20℃静置3-5min， 然后4℃，13000rpm离心5-15min。

前述的方法，步骤5)具体为：弃去上清液，RNA沉淀用0.5-1.0mL 75％乙醇冲洗2次，然后4℃，13000rpm离心3-5min；弃去上清液， RNA沉淀再用0.5-1.5mL无水乙醇冲洗1次，然后4℃，13000rpm离心 3-5min；去除乙醇，RNA置于超净工作台室温干燥3-5min，然后用 不含RNA酶的灭菌水80-100μL溶解，-80℃保存。

优选地，所述方法包括以下步骤：

1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)0.1mg，剪碎后，分2-3次加入20mL 液氮，在3min内将叶片研磨成粉末，倒入离心管中，操作在超净工 作台上完成(避风环境)；

2)向上述粉末中加入1mLTrizol裂解液，将离心管置于旋窝机 中剧烈震荡后室温静置3min，然后4℃，12000rpm离心5min；

3)将上清液置于另一离心管中，向上清液中加0.2mL氯仿，盖 紧离心管，用手剧烈摇荡20s后，室温静置5min，然后4℃，13000rpm 离心10min；

4)将上清液转移至另一离心管中，加等体积的4℃异丙醇，上下 颠倒摇匀，-20℃静置5min，然后4℃，13000rpm离心10min；

5)弃去上清液，RNA沉淀用0.8mL75％乙醇冲洗2次，然后4℃， 13000rpm离心5min；弃去上清液，RNA沉淀再用1.0mL无水乙醇冲 洗1次，然后4℃，13000rpm离心5min；去除乙醇，RNA置于超净工 作台室温干燥3-5min(注意不要过分干燥)，然后用不含RNA酶的灭 菌水80μL溶解，-80℃保存。