[发明专利]猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量PCR检测方法。选择猴免疫缺陷病毒SIV的gag基因、猴逆转D型病毒SRV1的5'LTR基因、猴T淋巴细胞趋向性病毒Ⅰ型STLV1的gag基因保守区序列作为检测靶序列，合成其DNA片段，并分别设计合成三对引物对及3条探针：SIV：上引物SI‑F、下引物SI‑R、探针SI‑P，SRV1：上引物SR‑F、下引物SR‑R、探针SR‑P，STLV1：上引物ST‑F、下引物ST‑R、探针ST‑P，建立三重实时荧光定量PCR检测方法，可对三种猴逆转录病毒进行精确定性检测。本发明还涉及检测用试剂盒，具有检测特异性高、准确性高、灵敏度好的优点。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus，SIV)，也称为非洲绿猴病毒(African Green Monkey virus)，是一种可影响至少33种非洲灵长目的逆转录病毒。SIV与与HIV病毒在基因序列上有较高的同源性，非人灵长类感染SIV后，出现类似AIDS的发病机制和临床症状表现，可在感染病毒后出现免疫系统的损害和多系统多器官组织的病变，SIV在恒河猴体内分布较为广泛，可累及包括免疫系统在内的多个系统。

猴D型反转录病毒(simian type-Dretro virus，SRV)属反转录病毒科、D型反转录病毒属，与猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)同为猴获得性免疫缺陷综合征(SAIDS)的一种致病病毒。目前已发现的SRV有5个血清型：SRV-1，2，3，4，5。SRV主要的靶细胞是淋巴细胞，感染后可造成淋巴细胞耗竭，诱发免疫缺陷。各型SRV的发生有其种属性和群体性，一旦传入易感猴群，可使80％以上的猴发病致死。

猴T淋巴细胞白血病病毒(simian T-lymphotropic virus,STLV1)，与人T淋巴白血病病毒(human T-lymphotropic virus,HTLV)统称为灵长类嗜T淋巴细胞病毒(primateT-lymphotropic virus,PTLV)，均属于逆转录病毒属。猴T淋巴细胞趋向性病毒最初从亚洲和非洲猴体内分离到，人工繁殖猴和野生猴均可被STLV1感染，但无临床症状表现。受STLV1感染的非洲绿猴出现了与受HTLV感染的人相似的贫血症，并且STLV1与人的HTLV的遗传同源性高达90-95％，有研究证明我国野生和饲养恒河猴血清广泛存在STLV1抗体。STLV1病毒主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的病变或免疫机能紊乱，从而干扰实验研究，是SPF猴必须排除的几种病毒之一。

多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于病毒检测领域。Weyer CT等建立了对非洲马瘟9种血清型分子分型的定性检测的三重实时荧光PCR方法；Haines FJ等建立了同时检测古典猪瘟和非洲猪瘟多重实时荧光RT-PCR方法；许建明等建立了同时检测三种鱼类弹状病毒的三重实时荧光PCR方法，结果显示多重PCR体系与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。但是到目前为止，尚无报道有同时检测SIV、SRV1和STLV1的试剂盒。

对于逆转录病毒而言，被该类病毒感染的动物常产生免疫抑制，导致血清中特异性抗体水平偏低，造成抗体检测出现假阴性现象，实时定量PCR通过直接对感染动物的病原体核酸特定片段进行扩增，检测扩增中荧光信号的强度变化，从而达到检测目的。该方法的优势在于，直接对逆转录病毒的核酸进行检测，提高了检测的特异性；而对于逆转录病毒核酸特定片段的扩增和放大，提高了检测的敏感性。