[发明专利]运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻转基因材料的构建，特别涉及运用CRISPR-Cas9系统敲除MIR393b 茎环序列的基因编辑方法。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物，也是单子叶植物研究的模式生物。miRNA393是植物 中一个保守的microRNA家族，通过转录后水平负调控生长素受体TIR1/AFBs家族蛋白 调控生长素信号通路。目前其功能研究主要包括植物免疫反应、生长发育和胁迫反应三 个方面。而在水稻中miR393的功能还知之甚少，主要是缺乏该基因的突变体材料。

在过去的数年中，主要采用模拟竞争靶基因的转基因手段进行水稻miRNA的功能研 究。但是模拟竞争靶基因的MIM393株系并不能完全消除MIR393基因的作用，并且不能 区分MIR393a和MIR393b基因的功能，因此有必要构建其MIR393a和MIR393b各自特异 的基因敲除株系，才能阐明该家族成员MIR393a/b基因真正的生物学功能。但是至今尚 未报道缺失MIR393a或MIR393b基因的水稻突变体。

CRISPR(clusteredregulatoryinterspersedshortpalindromicrepeat)序列 是一段带有间隔序列具有回文结构的多个重复序列，它源于原核生物的一种获得性免疫 系统。近年来，基于RNA介导的CRISPR-Cas系统蓬勃发展起来，该系统可定点修饰(删 除、添加、激活、抑制)靶细胞中特定的基因序列，为靶向性编辑基因组序列提供行之 有效的技术手段。但是，目前尚无运用该技术敲除水稻MIRNA基因茎环序列的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种运用CRISPR-Cas9系统 敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法，以获得完全丧失miR393b茎环序列及其 表达的理想突变体。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法，包 括以下步骤：

(1)gRNA靶位点的选择

由于MIR393b基因位于水稻基因组的第四号染色体上，根据CRISPR-Cas9技术的设 计靶位点的原则，把第一个靶位点设计在MIR393b基因的前体茎环序列上，第二个靶位 点在茎环序列下游3’端；

(2)gRNA的片段克隆

以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆三个片段L1、L2、L3部分重叠的片段，引物 序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：

L1F：cgggtctcaggcaggatgggcagtctgggcaacaaagcaccagtgg

L1R：cgggtctcagcgttgggcttctgcaccagccggg

L2F：taggtctccacgctagcacacgttttagagctaggaa

L2R：cgggtctcattcctcaggccgtgcaccagccggg

L3F：taggtctccggaaactagtgggttttagagctagaa

L3R：taggtctccaaacggatgagcgacagcaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg

PCR体系为：Phusion酶0.5μl；5×Buffer10μl；引物各2.5μl；水30μl； dNTP4μl；pGTRplasmid0.5μl；

PCR反应条件为：预变性95℃,5min；变性95℃，30s，；退火60℃,30s；延伸72℃,30s； 共33个循环；最后延伸10min；

PCR反应后，取5-10μl产物，用2％的琼脂糖凝电泳检测后，纯化回收目的片段， 测定三个PCR产物L1、L2、L3的浓度；

(3)进行GG(gRNA-gRNA)连接

根据测定的PCR浓度，将三个片段等量混合，T7酶连接反应与BsaI酶切同时进行；

取L1、L2、L3各2μl，与10μlT7ligasebuffer、1μlBsaI–HF、0.5μlT7 ligase、2.5μl水混合；在PCR仪中进行如下反应：37℃,5min；20℃,10min；30-50 个循环；