[发明专利]一种微藻胞内代谢物样品提取方法

权利要求书

1.一种用于微藻代谢胞内代谢物样品制备的方法，其特征在于，具体操作如下：

(1)冰浴失活胞内酶：将微藻液体培养基或与待处理微藻胞内渗透压相当的等渗溶液，于离心试管冷冻制备冰斜面；所使用的培养基或者等渗溶液体积为最多不超过离心试管体积的一半；取出离心试管，将待分析的微藻培养液直接加入到冰斜面上，体积不超过冰斜面所用溶液的体积；剧烈振荡直至离心试管内冰刚刚融化消失，得细胞悬液；

(2)离心收集细胞：将(1)中的细胞悬液迅速转移至预冷的-4至4℃离心机中，在2000～12000g转速下离心5～10分钟，收集细胞，弃上清；

(3)细胞清洗：将收集的藻细胞用与待分析的微藻培养液体积相同的步骤(1)中制备冰斜面的溶液重悬后，按照步骤(2)条件离心收集细胞，弃上清，进行细胞清洗；其中，制备冰斜面的溶液需要预冷至-4至4℃；重复该步操作1～3次；最终获得的细胞沉淀可以保存于-80℃或者直接进行步骤(4)的操作；

(4)超声破碎：按照每1x10⁸～3x10⁸个细胞加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的比例，将二氯甲烷和/或氯仿加入到所收集的细胞沉淀中，在-4至4℃冰水混合物中进行超声破碎，按照超声5～8s，停止5～15s间隔循环操作至溶液中无肉眼可见细胞聚集体；

(5)萃取：对应于上述每加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的步骤(4)体系，再加入1mL0～4℃预冷的甲醇水溶液，甲醇水溶液中甲醇和水的体积比1:3～1:5，体系中甲醇水溶液与二氯甲烷和/或氯仿溶液的体积比为1:2，充分混合，0～4℃静置5～10分钟至体系明显分层，4℃，12000g离心10分钟，获得三相分层体系，其中上层为水相，下层为有机相，中间固形物层；将上述三相分别取出，即可用于后续分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：于所述二氯甲烷和/或氯仿中、以及萃取使用的甲醇水溶液中的一种或二种以上溶液内，可以根据需要加入内标物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：水相内标物可以是同位素标记的氨基酸、核酸、葡萄糖衍生物、甘油衍生物或待检测的目标分子中的一种或二种以上；有机相内标物可以是同位素标记的脂肪酸或待检测的目标分子中的一种或二种以上。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻是真核微藻或是原核的蓝藻。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)将经过0.22微米滤膜过滤除菌的微藻培养基或与待处理微藻胞内渗透压相当的等渗溶液，于15mL或50mL离心试管中存放于-80℃冰箱中，制备与水平方向成15-75度的冰斜面；所使用的培养基或者等渗溶液体积为离心试管体积的1/20至1/2；取出离心试管，将待分析的微藻培养液直接加入到冰斜面上，体积与冰斜面所用溶液体积之比为1/20至1；剧烈振荡直至离心试管内冰刚刚融化消失。

6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于：

对于淡水藻，其等渗溶液为生理盐水或30～50mM磷酸缓冲液；

对于海水藻，其等渗溶液为质量体积(g/ml)浓度为2.5～3.0％食盐水；

等渗溶液的pH需调整与微藻培养条件一致。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)的操作；以2mL上述体系为例，超声功率300-500w，按照超声5～8s，停止5～15s间隔循环操作至溶液中无肉眼可见细胞聚集体。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)获得三相分层体系，其中上层为水相，其中主要是极性分子；下层为有机相，其中主要是非极性分子，中间固形物层，其为多糖和蛋白质。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述后续分析是指包括重量法测定各组分重量，和/或下述分析方法中的一种或二种以上；

或利用薄层色谱、柱层析、气相色谱、液相色谱或色谱-质谱联用方法测定有机相代谢物；

或利用液相色谱或色谱-质谱联用方法或衍生化后通过气相色谱或色谱-质谱联用方法测定水相代谢物；

或利用酶解、消化方法处理后测定中间固形物中糖的构成以及氨基酸或多肽的构成。