[发明专利]以CA19-9 cDNA片段为模板制备RNA探针的方法

说明书

本发明提供了一种以CA19‑9 cDNA为模板制备RNA探针的方法。该方法包括以下步骤：针对CA19‑9 mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；从CA19‑9 cDNA质粒中，采用上述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。本发明得到的cRNA探针能够全部覆盖所有靶序列，简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，探针特异性更高，稳定性更强，背景信号更低且灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了一种快速检测胰腺癌相关的CA19‑9表达的试剂盒。

技术领域

本发明属于核酸诊断领域，具体涉及一种以CA19-9cDNA片段为模板制备RNA探针的方法及其应用。

背景技术

荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种重要的非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA或RNA分子杂交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特异探针杂交后结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全性较高；FISH的实验周期短，探针稳定性强；通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；FISH的分辨率高达3-20Mb；FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成多色探针。

FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。cRNA探针比cDNA探针有更多的优势：避免了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性；cRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂交体更稳定；且cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。

制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输的相关试剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种肿瘤的高品质探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的经济效益、社会效益及广阔的市场前景。

CA19-9(carbohydrate antigen 19-9)是一种粘蛋白质的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因由鼠单克隆抗体119NS199-9识别而命名。CA19-9是一种分子量为5000KD的低聚糖类肿瘤相关抗原，由内胚层细胞分化而来的，正常人血清中含量甚微，而在多种上皮类恶性肿瘤血清中均可见增高。

在血清中CA19-9以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处。正常情况下CAl9-9的合成量极微，但当上述组织出现异常时，尤其是恶性肿瘤时，其合成量可以显著增加，造成血清中的CAl9-9增加。CAl9-9是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物，胰腺癌的CA19-9最高水平是正常均值的683倍，故其是胰腺癌较好的标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法。