[发明专利]一种羊草金属硫蛋白基因LcMT3的克隆方法

说明书

本发明公开了一种羊草金属硫蛋白基因LcMT3的克隆方法，该方法包括以下步骤：羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析；半定量RT‑PCR分析羊草LcMT3基因的组织表达模式；半定量RT‑PCR分析羊草LcMT3基因的胁迫诱导表达模式；LcMT3基因酵母表达及耐盐性鉴定；LcMT3基因原核表达、纯化及耐盐性鉴定。本发明实施例提供的羊草金属硫蛋白基因LcMT3的克隆方法操作过程严谨科学，为金属硫蛋白在科研和生产中的应用提供了重要作用。

技术领域

本发明属于金属硫蛋白制备领域，尤其涉及一种羊草金属硫蛋白基因LcMT3的克隆方法。

背景技术

羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)又名碱草，它是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。我国东北部松嫩平原及内蒙古东部为其分布中心，在河北、山西、河南、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省(自治区)均有分布。

羊草抗寒、抗旱、耐盐碱、耐土壤瘠薄，适应范围广。羊草在漫长的进化过程中积累了丰富的抗逆基因，形成了一套完善的抗逆机制。

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类在动物、植物和微生物体内均广泛存在，富含半胱氨酸(Cys)残基，能被金属诱导的低分子量金属结合蛋白。

早在1957，Margoshes和Vallee在研究重金属锡的生物学功能时，从马肾的细胞中首次分离除了动物MT。Casterline和Barnett于1977年从大豆根中首次发现植物MT。目前已从拟南芥、水稻、玉米、番茄、豌豆等多重植物中发现并克隆了植物MT基因。根据植物MT中Cys残基的位置和排列方式，将植物MT分为4个亚家族，分别为MT1、MT2、MT3和MT4(Binz etal,1999)。

MT参与了植物许多生理过程，如生长发育、胚胎发生、小孢子发生、衰老、果实发育、成熟和抗逆等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊草金属硫蛋白基因LcMT3的克隆方法，旨在解决目前克隆羊草金属硫蛋白基因LcMT3的方法简陋的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种羊草金属硫蛋白基因LcMT3的克隆方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析；

步骤二、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的组织表达模式；

步骤三、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的胁迫诱导表达模式；

步骤四、LcMT3基因酵母表达及耐盐性鉴定；

步骤五、LcMT3基因原核表达、纯化及耐盐性鉴定。

进一步，羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析的具体方法为：

1)处理羊草种子；

2)提取羊草叶片总RNA；

3)3’RACE；

4)RT-PCR克隆羊草LcMT3全长基因；

5)生物信息学分析。

进一步，处理羊草种子的方法为：

羊草种子在蛭石中萌发，室温光照16小时，温度25℃培养，用1/2MS浇灌至四叶期，每隔三天浇一次，用100mmol/L Na₂CO₃胁迫处理24小时后，取羊草叶片至于液氮中冷冻保存。

进一步，3’RACE的具体步骤如下：