[发明专利]一种绵羊角蛋白抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及文物考古技术领域，尤其涉及羊毛制品文物检测领域。

背景技术

绵羊毛是一种天然动物毛纤维。具有角质组织，呈现光泽，坚韧并有弹性。因其产量高、种类多，可生产多种毛织品，是主要的毛纺工业原料。

中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品，这些古代羊毛制品蕴藏着大量的考古信息。通常对羊毛制品的鉴定主要是对羊毛角蛋白的鉴定。羊毛角蛋白是一种硬化，不易溶解的蛋白质，其中既有含羧基等在内的酸性基，也有含胺基，亚胺基等在内的碱性基，所以在酸、碱、盐、氧化剂、还原剂、卤素等中羊毛都具有一定的不稳定性。这对羊毛制品的鉴别造成了一定困难。

目前，蛋白质检测技术如基于抗原-抗体结合的酶联免疫技术是一种广泛用于文物检测的先进技术，而前期的羊毛羊角蛋白抗体制备是一大难题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种绵羊角蛋白抗体的制备方法。本发明方法制备的绵羊角蛋白抗体对绵羊角蛋白的反应灵敏度高，所需使用的抗原量极少。

本发明的具体技术方案为：一种绵羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下：

A）配制5-7wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为3.5-5；接着按1:（40-60）的浴比将绵羊毛添加到溶液中，在30-35℃下水浴震荡0.5-1.5h；然后取出羊毛并水洗至中性；将羊毛加入到其50-90倍质量的混合溶液A中，在95-105℃下反应3.5-4.5h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液透析、冷冻干燥后制得绵羊角蛋白粉。

本发明方法提取制得的绵羊角蛋白粉，纯度高，复配成抗原液后效果好。

B）用生理盐水将上述制得的绵羊角蛋白粉配制成0.75-1.25mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与QuickAntibody-Rabbit5W佐剂按体积比1:(0.8-1.1)混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫；当兔子血样中的抗体效价达到1:20000时，收集兔子血液。

本发明使用的QuickAntibody-Rabbit5W佐剂无毒无害，不含蛋白质成分，不破坏抗原天然构型，而且免疫方式简单，无需乳化抗原，只需要简单混合即可免疫，同时免疫周期短，抗原用量少。

C）从上述收集的血液中分离得到抗血清。

D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌后抽真空20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液；将蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；对蛋白柱进行清洗；对上述制得的抗血清进行稀释，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；对蛋白柱再次清洗，用甘氨酸溶液对抗体进行洗脱，洗脱后清洗蛋白柱，制得抗体。

本发明采用绵羊角蛋白制备而得的抗体具有较强的特异性，该抗体能够与绵羊角蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度高，能够对古代绵羊毛制品中已经断裂的绵羊角蛋白分子做出检测。

作为优选，骤A）中的所述混合溶液A由亚硫酸氢钠、尿素、十二烷基苯磺酸钠和水组成；其中亚硫酸氢钠的浓度为5wt%，尿素的浓度为6M，十二烷基苯磺酸钠的浓度为1wt%。

本发明的混合溶液A中，亚硫酸氢钠能够迅速打开羊毛硫蛋白中的二硫键，使羊毛鳞片层受损，从而利于溶剂进入皮质层。尿素的能够加快溶解羊毛的速度。而十二烷基苯磺酸钠能够降低溶液表面张力，促使溶液渗透进入羊毛内部，增加羊毛的溶解率。同时亚硫酸氢钠以及十二烷基苯磺酸钠的钠离子具有强烈水化能力，对羊毛产生溶胀作用，使得皮质层中的物质溶出。本发明采用阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠，成本低，临界胶束浓度低，用量少。

作为优选，步骤A）中的所述混合溶液A由亚硫酸氢钠、尿素、皂素、十二烷基苯磺酸钠和水组成；其中亚硫酸氢钠的浓度为5wt%，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8wt%。

上述混合溶液A中的皂素为天然非离子表面活性剂，与十二烷基苯磺酸钠复配使用后，对羊毛的渗透能力更强，对角蛋白的提取率有提高作用。