[发明专利]利用荧光定量PCR鉴定鱿鱼或其深加工产品种类的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种适用于鱿鱼及其深加工产品种类的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

鱿鱼(Squid)，又称句公、柔鱼或枪乌贼，是头足纲(Cephalopoda)、枪形目 (Teuthida)中多种10腕头足类软体动物的俗称。其身体狭长，呈枪形。嗅觉突由两个突起组 成，眼眶外覆盖透明角膜，环口附肢10腕。喷水推进能力强，适于快速游泳。鱿鱼广泛分布于 世界各大洋，已知分布水层为0～3000m。市场上常见的鱿鱼一般是开眼亚目(Oegopsida)的 柔鱼科(Ommastrephidae)品种和闭眼亚目(Myopsida)的枪乌贼科(Loliginidae)品种。在 中国本土市场，最常见的鱿鱼是柔鱼科的秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)、阿根廷鱿鱼(Illex argentinus)、日本海鱿鱼(Todarodespacificus)和北太平洋鱿鱼(Ommastrephes bartramii)。

鱿鱼类的平均可食用部分约占85％，比一般鱼类高约25％。肉质鲜美，富含蛋白 质、牛磺酸、钙、磷、铁等人体必需的成分，且必需氨基酸组成接近全蛋蛋白，营养价值非常 高。市场上的鱿鱼除了直接鲜销，还会经加工来供应市场。常见的鱿鱼加工形式有：冻品，如 冻鱿鱼胴片、冻鱿鱼圈等；干品，如鱿鱼鲞、鱿鱼耳等；熟食产品，如鱿鱼丝、鱿鱼仔、鱿鱼罐 头等。日本和欧盟是鱿鱼的主要消费市场，日本以进口冷冻和干制品为主，欧盟则大部分进 口冷冻品。近年来，美国、中国等国家或地区的鱿鱼市场也逐渐扩大。

因为产地、营养成分、口味的差异，不同鱿鱼品种的市场价相差巨大。例如，阿根廷 鱿鱼肉质肥厚、口感鲜嫩，所以价格较高；秘鲁鱿鱼资源丰富，个体大，但含有特殊酸味且肉 质较差，所以价格较低。而当鱿鱼进行切片、熟制等加工过程，其可供鉴别的形态学特征基 本不存在，这可能会导致不法商贩以次充好的欺诈行为。虽然很多国家、地区和组织都有相 应的法规，规定在水产品的标签中明确其种类和来源，但是掺假造假的判定和标签制度的 有效实施，必须是建立在快速、准确的鱿鱼品种鉴定的基础上的。目前该领域国内的研究还 在起步阶段。因此，为了规范鱿鱼市场，维护消费者的知情权，迫切需要建立灵敏、可靠的检 测方法和检测体系来鉴定鱿鱼类产品原鱼料的品种。

目前，已报道的鱿鱼种类鉴定的方法有传统形态学法、蛋白质电泳法和DNA分子遗 传标记方法。形态学方法依赖于专业人士的长期工作经验，对亲缘关系相近的相似种的判 断并非有效。而且对于市面上常见的加工过鱿鱼产品(鱿鱼丝、罐头等)，可供种类鉴别的形 态学特征几乎不存在；蛋白质分析方法不适用于深加工产品，因为产品加工过程中的热处 理使蛋白质的生化特性及其结构完整性都被破坏；而基于DNA技术的分子生物学方法，就显 示出明显优势：1)DNA比蛋白质耐热性强；尽管DNA在加工过程中也会被降解，但是仍然能提 取出小片段的DNA；2)作为生物体的遗传物质，DNA分子能够提供更多信息；3)DNA分子稳定， 不受组织类型、年龄及生理状态等因素的影响。

DNA分子技术用于种类鉴定有多种常见方法，如限制性片段长度多态性(RFLP)标 记、单碱基多态性(SNP)标记、微卫星(microsatellite)标记、DNA条形码技术(DNA barcode)、荧光定量PCR技术等。

RFLP首先需要对目标DNA片段进行PCR扩增，然后选择合适的限制性内切酶切割扩 增片段，通过琼脂糖凝胶电泳获得不同物种的限制性酶切片段图谱。该方法花费低，操作简 单，但也存在诸多缺点：1)、由于存在种内变异以及不同密码子的简并性特征，同一物种不 同个体可能存在不同的限制片段酶切图谱；2)、除生鲜鱿鱼和冷冻鱿鱼外，鱿鱼深加工产品 (如鱿鱼丝、鱿鱼饼、鱿鱼罐头等)在加工过程中通常使用长时间(>15min)高温(>115℃)处 理，DNA分子常降解为100-200bp的小片段，这可能严重影响酶切片段的多态性的判断。