[发明专利]一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺

权利要求书

1.一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在 于，用一步Q-Sepharose阴离子交换层析及一步亲和层析纯化得到纯度较高的vWF：收集冷 沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制备中经层析柱流出来的液体作为 原料；通过Q-Sepharose离子交换柱层析后，收集洗脱液，再经明胶亲和层析，去除残余的 纤维结合蛋白及杂质，得到血管性血友病因子。

2.根据权利要求1所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子 的制备工艺，其特征在于，冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的的制备工艺包括：冷沉淀溶解、凝胶吸 附、调节离子强度、串联过滤、S/D灭活、离子交换层析；离子交换层析收集洗脱液，洗脱 液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产；优选在S/D灭活前的凝胶吸附为添加2％ 氢氧化铝凝胶进行吸附。

3.一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在 于，收集冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制备中经层析柱流出来 的液体作为原料；在血管性血友病因子的制备工艺中，对经层析后的蛋白液在层析缓冲液中 加入甘氨酸保护vWF活性；优选层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白作为 冻干保护剂，保护vWF活性；优选层析缓冲液中甘氨酸质量浓度0.6％～1％，冻干保护剂中 赖氨酸质量浓度2～3％，甘氨酸质量浓度0.2％，白蛋白质量浓度0.8～1.3％。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友 病因子的制备工艺，其特征在于，

(1)通过调整洗涤缓冲液B和洗脱缓冲液B中的盐浓度；采用Q-Sepharose柱层析法去 除纤维蛋白原和纤维结合蛋白及其它杂蛋白；

(2)经Q-Sepharose柱层析后的洗脱液，再经明胶层析，通过调整洗脱缓冲液B和透析 液的盐浓度，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，即得含高纯度vWF的流穿液。

5.根据权利要求2所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子 的制备工艺，其特征在于，S/D灭活前串联过滤使用的滤芯尺寸为1.0μm和0.45μm的滤芯。

6.根据权利要求2所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子 的制备工艺，其特征在于，离子交换层析流穿液收集后，先浓缩一倍，再用洗涤缓冲液B等 体积超滤6次，再经Q-Sepharose层析柱，用洗脱缓冲液B收集洗脱下来的蛋白液。

7.根据权利要求4所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子 的制备工艺，其特征在于，所述的洗涤缓冲液B的配方：4g枸橼酸钠，11.4g氯化钠，3g氯 化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为5.8～6.8。

8.根据权利要求4所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子 的制备工艺，其特征在于，所述的洗脱缓冲液B配方：4g枸橼酸钠，16.38g氯化钠，3g氯 化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为5.8～6.8。

9.根据权利要求4所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子 的制备工艺，其特征在于，所述的透析液配方：2.94g枸橼酸钠，25g氯化钠，0.111g氯化 钙，30g甘氨酸，2g盐酸赖氨酸，人血白蛋白8g，加适量注射用水充分溶解，补加注射用 水至1L，调节pH为6.8～7.2。

10.根据权利要求1所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子 的制备工艺，其特征在于，制备工艺如下：

(1)收集冷沉淀；

(2)将步骤(1)的冷沉淀加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水 的温度控制在28～37℃；开始离心，收集上清液，称重；

(3)将步骤(2)的制得物上清液用1mol/LHCL调节pH至6.0～7.0；加入2％氢氧化 铝凝胶，搅拌；开始离心，收集上清液，称重；

(4)按“调节离子强度缓冲液W＝上清液重量/10”计算，称取计算量的调节离子强度缓 冲液至步骤(3)的制得物上清液中；调节上清液pH至6.0～7.0；用调节蛋白浓度缓冲液调 节蛋白浓度不大于10g/L；用1.0μm的滤芯和0.45μm的滤芯串联过滤，收集过滤液，称重；

(5)按步骤(4)的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～ 26℃，连续保温6小时；0.45μm滤芯过滤；过滤液用30KD超滤膜浓缩至蛋白浓度2％，然 后用蛋白液重量的2倍以上洗涤缓冲液A恒体积超滤，得超滤液，称重；

(6)将步骤(5)的制得物超滤液用离子交换柱进行层析纯化，用洗涤缓冲液A洗涤柱 子直至成基线，用洗脱缓冲液A洗脱，收集洗脱液；

(7)收集步骤(6)经层析柱流出来的液体，浓缩一倍，洗涤缓冲液B等体积超滤6次， 得超滤液，称重；

(8)将步骤(7)的制得物超滤液用Q-Sepharose阴离子交换层析柱进行层析纯化，用 洗涤缓冲液B洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液B洗脱，收集洗脱液，称重；

(9)将步骤(8)的制得物洗脱液明胶亲和层析进行纯化，用洗脱缓冲液B洗涤柱子直 至成基线，收集上样后经层析柱流出来的液体，用透析液透析、稀释至效价100IU/ml，得蛋 白液，称重；

(10)将步骤(9)的制得物蛋白液经0.2μm除菌滤芯过滤分装；分装好的制品传入冻干 柜进行冷冻干燥；出柜扎盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、 入库；

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数；

优选：步骤(4)所述的调节离子强度缓冲液的配方：离子强度缓冲液的配制方法：48.5g 三羟甲基氨基甲烷，10g氯化钙，100g氯化钠，28.1g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解， 补加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0；蛋白浓度缓冲液的配制方法：量取0.05L调节离 子强度缓冲液，加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0；

优选：步骤(5)所述的洗涤缓冲液A的配方：2.5g三羟甲基氨基甲烷，10g氯化钙，25g 氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0；

优选：步骤(6)所述的洗脱缓冲液A配方：2.5g三羟甲基氨基甲烷，15g氯化钙，40.9g 氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0。