[发明专利]球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢产物的提取方法及抗肿瘤应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢 产物的提取方法及抗肿瘤应用。

背景技术

球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus，Bs)，革兰氏染色呈阳性，是一种末端 有膨大的内生孢子囊的好氧细菌，其菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，并且 闪着油脂样的光，菌落为白色或淡黄色。球形芽孢杆菌的培养体有营养体期和 芽孢期两个发育阶段，其中二元毒素蛋白在其芽孢期产生。球形芽孢杆菌的细 胞形态在不同发育阶段的形态有所不同。营养体期细胞形态为杆状，周围有鞭 毛，并且活动活跃。在芽孢期时，由于芽孢的形成使菌体的末端膨大，呈鼓槌 状突起，待芽孢成熟，伴胞晶体被包在芽胞外膜内。不同的球形芽孢杆菌的芽 孢其形态和大小都不同。在球形芽孢杆菌生长时期，有些菌株会产生伴胞晶体， 有些不产生。伴胞晶体与杀蚊活性相关。所有的球形芽孢杆菌，由于缺乏三羧 酸循环的中间酶导致其不能代谢糖类物质，但是可以利用其它碳化合物作为碳 源。球形芽孢杆菌在40℃生长，生物素、硫胺素等生长因子能促进其生长。

在芽孢形成时期两个蛋白相互作用折叠组成晶体，单独表达的BinA和 BinB不能形成伴胞晶体，只能形成无定形包含物。只有BinA蛋白对蚊虫有毒， 但是毒力比较小。单独的BinB对蚊虫无毒，但是能够增强BinA蛋白的毒力。 只有它们同时存在，才能对蚊虫有较高的毒性。Western-Blot实验表明BinA和 BinB蛋白间没有交叉反应，说明这两个蛋白之间没有同源性。一般认为，BinA 决定毒素蛋白的杀蚊活性和特异性，而BinB主要与蚊幼虫的肠敏感位点特异 性结合。二者同时存在，才能发挥毒素蛋白的杀蚊毒性。

生物毒素是由生物体产生并使其他生物体受到伤害或者致死的物质。生物 毒素不仅具有毒理作用，还具有药理作用。生物毒素也称为天然毒素，包括植 物、动物、微生物所产生的有毒物质。根据作用机理，这些毒素分为：细胞溶 解霉素、直接作用于细胞、抑制蛋白质合成、作用于离子通道、作用于细胞骨 架、溶血或凝血的毒素等。生物毒素一般均有抗癌活性，有些生物毒素对肿瘤 细胞具有直接杀伤作用，有些生物毒素抑制肿瘤的血管再生，从而抑制肿瘤生 长。

微生物代谢产物包括毒素，在治疗和/或抑制肿瘤或在肿瘤辅助诊断、预 后中有广泛应用，包含球形芽孢杆菌2317-2的基因重组或组合物及其抗癌作 用等生物活性，及其应用上的基因重组或组合物、相关代谢产物、生物毒素的 抑制/杀灭真菌、细菌、蚊虫、肿瘤细胞等生物活性及其应用。然而，目前关 于球形芽孢杆菌2317-2的胞外代谢产物的相关抗肿瘤方面的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢产物的提取方 法及抗肿瘤应用，经该提取方法分离纯化得到了球形芽孢杆菌2317-2胞外代 谢产物二元毒素晶体蛋白，经证实该二元毒素晶体蛋白能够有效应用于抗肿瘤 药物的制备中。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢产物在制备抗肿瘤药物 中的应用，所述球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢产物为二元毒素晶体蛋白。

所述二元毒素晶体蛋白是由等量的41.9kDaBinA和51.4kDaBinB组成。

所述的药物为抗肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7或乳腺 癌HELA的药物。

所述的药物为促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖或抑制肿瘤细胞迁移 的药物。

本发明还公开了上述的球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢产物的提取方法， 包括以下步骤：

1)将球形芽孢杆菌2317-2在LB固体培养基上活化后，接种于LB液体 培养基中，在30℃下震荡培养过夜；

2)以1:100的比例，将培养过夜的菌液转接入MBS培养基中，震荡培养 至芽孢晶体从菌株中完全释放，收集发酵液，离心取沉淀，将沉淀洗涤后重悬 处理，然后在超声波处理，直至晶体、芽孢及细胞碎片充分分散，震荡混匀， 除去泡沫，离心，取沉淀；

3)向沉淀中加水制成悬液，再加入溶菌酶，使悬液中溶菌酶的终浓度为 0.1～0.2mg/ml，然后再37℃处理2～3h，期间每30min取出轻柔混匀数次，然 后离心收集沉淀；