[发明专利]一种基于双分子荧光互补技术的筛选互作蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种基于双分子荧光互补技术的筛选互作蛋白的方法。该方法包括：1)将YGFP分成N端(序列1第1‑157位)和C端(序列1第158‑238位)；在N端编码基因3’末端通过连接序列(编码序列2所示连接肽)连接目的蛋白A的编码基因，形成融合基因片段A；在C端编码基因5’或3’末端通过所述连接序列连接目的蛋白B的编码基因，形成融合基因片段B；2)将融合基因片段A和B导入受体酵母细胞，培养所得转基因酵母细胞，检测其是否产生绿色荧光，若产生绿色荧光，则目的蛋白A与B互作或候选互作；若不产生绿色荧光，则目的蛋白A与B不互作或候选不互作。本发明建立的BiFC技术具有较高的敏感性和特异性，适合于在酵母中开展高通量蛋白质相互作用筛选。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于双分子荧光互补技术的筛选互作蛋白的方法。

背景技术

蛋白质构成生命活动的基础，蛋白质之间的相互作用几乎存在于所有的生命活动现象中，它们之间形成复杂的相互作用网络来共同调节各种生命活动，因此规模化的蛋白质相互作用网络连锁图的绘制将有助于揭示蛋白质之间的相互作用，进而阐明蛋白质的生物学功能，使我们能够从分子水平上理解生命现象的本质。据估算在人类蛋白质中存在着130000对相互作用，而现有的相互作用网络只揭示了其中很小的一部分，因此仍有大量的相互作用蛋白有待于进一步挖掘。

现阶段，大规模蛋白质相互作用筛选技术主要有酵母双杂交技术和亲和纯化串联质谱技术，虽然通过这两种技术已经建立了多个物种的蛋白质互作网络图谱，但这两项技术存在着一定的局限性，比如酵母双杂交技术只能研究核内蛋白质间的相互作用且存在自激活和假阳性等问题，而亲和纯化串联质谱技术会在纯化过程中丢失较弱的相互作用蛋白且需要后续的蛋白质数据分析和检测费用较高等不足。因此建立一种实验周期短、可信性高的蛋白质相互作用筛选技术，将会弥补以上两种技术的不足，进而丰富和完善蛋白质相互作用网络。

双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescent complementation,BiFC)是近年来用于研究蛋白质相互作用的新技术，它是通过将荧光蛋白分为不发光的N端和C段两个部分，分别与目的蛋白进行融合，如果目的蛋白间存在相互作用，又会重新将N端和C段拉近到一起，组装成荧光蛋白而产生荧光。由于该技术具有方便、快速且能用于活体细胞内相互作用蛋白检测的特点，其应用日益广泛。采用BiFC技术进行高通量蛋白质相互作用筛选在哺乳动物细胞和酵母中有相关的报道，然而分别存在着工作量大、费用高和荧光背景值高的问题。因此，需要开发出一种适合于酵母中表达的高信噪比的BiFC系统，以便在高通量筛选相互作用蛋白的同时，能够降低筛选的成本和费用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测目的蛋白A与目的蛋白B是否为互作蛋白的方法。

本发明所提供的检测目的蛋白A与目的蛋白B是否为互作蛋白的方法，具体可包括如下步骤：

(1)将绿色荧光蛋白分成N端部分和C端部分；在所述N端部分的编码基因的3’末端通过连接序列(linker)连接目的蛋白A的编码基因，形成融合基因片段A；在所述C端部分的编码基因的5’末端或3’末端通过所述连接序列(linker)连接目的蛋白B的编码基因，形成融合基因片段B；

所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述N端部分的氨基酸序列如序列表中序列1的第1-157位所示；所述C端部分的氨基酸序列如序列表中序列1的第158-238位所示；所述连接序列编码序列表中序列2所示连接肽；

其中，所述连接肽的加入是为了使目的蛋白能够充分折叠。