[发明专利]基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法

说明书

本发明提供了基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法。采用适体自组装网络型核酸纳米探针和酶循环放大技术，以达到对靶DNA的痕量检测。其设计原理为：将三叉DNA1和三叉DNA2的末端分别设计为能够特异性识别凝血酶的适体序列1和适体序列2，使两种三叉DNA通过与凝血酶的特异性识别互相连接，形成网络型结构。其中，适体序列1和适体序列2又为富G序列，能与氯化血红素结合形成大量过氧化物模拟酶，催化反应底物产生放大的检测信号。通过本方法，可实现对靶DNA的超高灵敏检测，无需复杂仪器设备,简单易行。

技术领域：

本发明属于生化分析技术领域，特别涉及基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法。

背景技术：

纳米材料具有表面效应、体积效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应等特点，已广泛应用于生物医学、光学、电子学等诸多领域。基于纳米材料所构建的纳米探针在分析化学，特别是生物分析化学等方面具有重要作用。目前常用的纳米探针有量子点、纳米金、磁性颗粒等。其中，基于核酸自组装所构建的纳米探针具有易标记、设计灵活、结构多样、稳定性好等优点，可实现目标分子的识别、信号的转换和放大等，在生物传感等领域具有重要作用和广阔的应用前景。

酶循环放大技术是采用工具酶进行的循环反应，反应过程中被测物浓度扩增，从而提高检测信号，实现被测物的高灵敏检测，在生物分子检测方面具有突出的优势。

比色法是通过比较或测量反应体系溶液颜色变化来确定待测组分含量的方法。通过定量测定反应液吸光度的变化，可提高测定的准确度，且无需复杂的仪器设备，简单便捷。

发明内容

本发明结合两种信号放大技术：适体自组装网络型核酸纳米探针和酶循环放大技术，以达到对靶DNA的痕量检测。其设计原理为：将三叉DNA1和三叉DNA2的末端分别设计为能够特异性识别凝血酶的适体序列1和适体序列2，使两种三叉DNA通过与凝血酶的特异性结合互相连接，形成网络型结构。其中，适体序列1和适体序列2又为富G序列，在与凝血酶特异性识别后，无需外加任何DNA，即可与氯化血红素形成大量过氧化物模拟酶，进而作为免标记核酸纳米探针，催化反应底物产生检测信号。

在96孔板表面包被戊二醛，通过共价方法固定捕获探针，该捕获探针需提前退火，以形成茎环结构；加入待测液，当有靶DNA存在时，靶DNA与捕获探针的茎环部分互补配对，从而将捕获探针打开；加入探针DNA，探针DNA一端可与被打开的捕获探针末端互补配对；加入聚合酶、内切酶和dNTPs，在聚合酶的作用下，探针DNA沿捕获探针生长，将靶DNA取代，被取代的靶DNA进入新一轮反应；在内切酶和聚合酶的作用下，发生剪切-复制反应，生成新的靶DNA，进而引发新的反应。因此，当有靶DNA存在时，通过此循环放大过程，极大地扩增了靶DNA的量。加入凝血酶和氯化血红素，探针DNA的另一端为凝血酶适体序列，可与凝血酶特异性结合；由于凝血酶适体序列为富G序列，在凝血酶的作用下，适体序列与氯化血红素形成过氧化物模拟酶；加入预先退火制备的三叉DNA1和三叉DNA2，通过凝血酶相互连接形成网络型结构；网络型结构中的适体序列与氯化血红素结合，形成大量过氧化物模拟酶，催化反应底物产生检测信号。因此，在DNA聚合酶和DNA内切酶的作用下，通过靶DNA引发复制-剪切反应，实现靶DNA的扩增；进一步在凝血酶、三叉DNA1和三叉DNA2的作用下，形成网络型结构。当有氯化血红素存在时，形成大量过氧化物模拟酶，催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺-过氧化氢反应体系，生成蓝色溶液，在650nm处产生紫外-可见吸收信号；反之，当无靶DNA存在时，生成无色溶液，在650nm处无法产生紫外-可见吸收信号。通过本方法，可实现对靶DNA的超高灵敏检测，无需复杂仪器设备,简单易行。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法，包括：

设计与靶DNA特异性结合后，能与探针DNA互补配对的捕获探针；