[发明专利]一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞的制备方法，具体为一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方 法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的细胞，在一定条件下可以分化为多种功能 细胞。根据干细胞所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞；胚胎干细 胞具有发育的全能性，能分化成成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞；成 体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新 并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。间充质干细胞是一种具有自我复制能 力和多向分化潜能的成体干细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转 变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形 成人体各种组织器官的始祖细胞，能分化成多种间充质系列细胞，如成骨、成软 骨和成脂肪细胞等。间充质干细胞存在于多种组织中，如骨髓、脐带血、脐带组 织、胎盘组织等。但是骨髓来源的间充质干细胞存在着细胞采集困难、对人体伤 害大、有年龄限制等问题。脐血、脐带、胎盘组织中分离出的间充质干细胞，不 仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且具有更强的增殖、分化能力，采集时 对身体无伤害，但是其组织材料的收集只能一次完成，局限于生产时的一瞬间， 错过时机将无法挽回。

2000年Gronthos首先提出牙髓干细胞(dentalpulpstemcells，DPSCs) 的概念，把一群从牙腔内提取出来，在体外具有克隆形成能力及高增殖率的一群 干细胞命名为DPSCs。2003年，Miura从脱落乳牙的冠和根的牙髓中分离出具 有多分化能力的干细胞，将其命名为乳牙牙髓间充质干细胞(stemcellsfrom humanexfoliateddeciduousteeth，SHED)。SHED体外培养时具有很高的增殖 能力和克隆形成能力，并可以分化成包括神经细胞、脂肪细胞和成牙本质细胞在 内的各种细胞，把体外培养的细胞移植回小鼠体内后可形成骨和牙本质。乳牙牙 髓来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性，因其来自乳牙采集方 便，有20次采集机会且无痛无创。SHED在胚胎发育方面与颌骨部组织具有相同 的来源，应用SHED来修复颌面部股损失也更为合适，SHED在取材过程中没有痛 苦，更为人们接受，并且脐带血库的成功建立为我们提供了一个很好地榜样或许 我们可以同样建立SHEDE库以备不时之需(在日本，香港，新加坡等国家和地区 已有乳牙牙髓干细胞库的成立)。

现有技术中乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法一般采用酶消化法，步骤繁 琐，而且培养体系成分不确定，给后序使用带来干扰。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的乳牙牙髓间充质干细胞采用酶消化 法所带来的步骤繁琐，培养体系成分不确定，给后序使用带来干扰的缺陷，提供 另一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，包括以下几个步骤：

一、乳牙牙髓间充质干细胞的分离及扩增培养

(1)将在医院检验合格且进行过初步清洗消毒的自然脱落或是人工拔除的 乳牙转运至实验室；优选的，乳牙转运至实验室时，保持乳牙在2～8℃的温度 下转运，且转运时间不超过48～96h，最好控制在48～72h，更优选的为48h；

(2)在超净工作台中，对乳牙进行二次清洗消毒灭菌，用液压钳压碎乳牙， 取出牙髓组织，将牙髓组织切碎后用间充质干细胞无血清培养基培养，获得牙髓 组织混合液；优选的，所述间充质干细胞无血清培养基为FasGrow培养基，每 500mL的无血清培养基中添加有25mL的添加因子，间充质干细胞无血清培养基 的主要成分是转铁蛋白、重组人血小板源生长因子、重组人表皮生长因子；

(3)将获得的牙髓组织混合液在温度为37℃，CO2体积分数为5％的培养箱 中培养；

(4)在培养的第7～10天，更换培养基，以后每2～3天对培养基进行三分 之一换液，培养至12～17天时，细胞汇合率达到70～80％时，进行传代培养。